服务介绍
生物膜干涉（Biolayer Interferometry，BLI）是由美国ForteBio公司（现属德国Sartorius赛多利斯集团）开发的一种基于光学干涉原理的无标记生物分子相互作用检测技术，其核心检测平台为Octet系列仪器（包括Octet RED96/RED96e、Octet R8/R4、Octet HTX、Octet K2及BLItz等型号）。BLI的基本原理是：一束白光通过光纤传导至生物传感器（Biosensor）尖端，在尖端的两个反射面——内部参比层（Internal Reference Layer）和外部生物膜层（Biolayer）表面——分别发生反射，两束反射光叠加形成干涉光谱。当传感器浸入样品溶液时，固定在生物膜层表面的配体（Ligand）与溶液中的分析物（Analyte）发生特异性结合，导致生物膜层的光学厚度增加，干涉光谱的**大干涉波长向长波方向移动（即nm shift），该波长偏移量与传感器表面结合的分析物质量成正比，可被光谱仪实时检测并记录为传感图（Sensorgram）。
BLI实验采用独特的"浸入即读"（Dip-and-Read）模式：生物传感器直接浸入96孔或384孔板的样品孔中进行检测，无需微流控系统和管路，从根本上避免了微流控堵塞和气泡问题，操作简便且维护成本低。Octet仪器可同时驱动8个（Octet R8/RED96）或16个（Octet HTX）传感器通道并行检测，配合机械臂自动完成传感器在不同孔间的转移，实现高通量自动化检测。一个完整的BLI动力学实验通常包括以下步骤：①基线（Baseline）：传感器在运行缓冲液中平衡，记录初始干涉光谱作为基线；②固定/捕获（Loading）：传感器浸入含配体的孔中，配体通过传感器表面的化学修饰被捕获或共价固定，监测固定量达到目标水平；③基线2（Baseline 2）：固定后的传感器在缓冲液中再次平衡，确保信号稳定；④结合（Association）：传感器浸入含不同浓度分析物的孔中，实时监测分析物与配体的结合过程，传感图信号上升；⑤解离（Dissociation）：传感器转移至不含分析物的缓冲液孔中，监测结合的分析物从配体上解离的过程，传感图信号下降；⑥再生（Regeneration）：传感器浸入再生液（如10mM Glycine-HCl pH 1.5-2.5、MgCl₂等），将结合的分析物和部分配体洗脱，传感器可重复使用（部分传感器类型可再生5-10次）。通过对不同分析物浓度下的结合-解离曲线进行全局拟合（Global Fitting），可获得结合速率常数ka（M⁻¹s⁻¹）、解离速率常数kd（s⁻¹）和平衡解离常数KD（kd/ka，M）。
BLI提供丰富的传感器类型以适配不同配体的固定需求：链霉亲和素传感器（SA, Streptavidin）用于生物素化配体（生物素化蛋白、核酸、多肽），固定牢固且均一；Anti-His传感器（Anti-Penta-His）用于His标签重组蛋白，通过抗体特异性捕获，条件温和；Ni-NTA传感器用于His标签蛋白，通过金属螯合捕获，可再生；Anti-Fc/Protein A/Protein G传感器用于抗体Fc段捕获，是抗体表征和表位分组的**；氨基反应性传感器（AR2G, Amine Reactive 2nd Generation）通过EDC/NHS共价偶联伯胺，适用于无标签蛋白和小分子；Anti-GST传感器用于GST标签蛋白；Biotin CAPture传感器可可逆捕获生物素化分子，便于传感器再生；SAX强阴离子交换传感器用于带负电荷的分子（如核酸）。BLI的核心优势在于高通量（8-16通道并行、96/384孔板）、无微流控（无堵塞、操作简单）、可检测粗样品（细胞培养上清、血清、裂解液）、传感器可再生重复使用，特别适合抗体表征（表位分组Epitope Binning、抗体滴度、亚型鉴定、亲和力排序）、蛋白-蛋白互作动力学、小分子/片段化合物筛选和疫苗开发等场景。BLI的局限性在于：需要将配体固定在传感器表面（可能影响活性）；对小分子（分子量<200Da）的检测灵敏度略低于SPR；96孔板开放式检测的温度控制精度低于SPR的密闭流路；扩散限制的传质效应（Mass Transport）在高亲和力快结合体系中可能影响ka测定精度。BLI实验需设置对照确保数据可靠：未固定配体的空白传感器（参考传感器）用于扣除非特异性结合和基线漂移；缓冲液空白孔用于扣除体积效应和溶剂折射率差异；已知互作对的阳性对照验证系统正常；无关蛋白或抗体的阴性对照验证结合特异性。
图：生物膜干涉（Biolayer Interferometry，BLI）实验原理与操作流程
服务优势
⚡
高通量并行检测
Octet平台8-16个传感器通道同时检测，兼容96/384孔板，单次实验可完成数十个样品或浓度梯度的动力学分析，是目前通量**高的无标记互作技术，适合抗体库筛选和表位分组。
🔧
无微流控操作简便
"浸入即读"模式无需微流控管路，从根本上避免堵塞、气泡和泄漏问题，仪器维护简单，实验设置灵活，可随时暂停和调整，适合复杂实验方案和粗样品检测。
🧫
兼容粗样品与多样场景
可直接检测细胞培养上清、血清、细胞裂解液等粗样品中的抗体或蛋白互作，无需纯化；丰富的传感器类型（SA/Anti-His/Anti-Fc/AR2G/Ni-NTA等）适配各类配体固定需求。
📊
动力学+亲和力完整交付
提供实时传感图、全局拟合的ka/kd/KD动力学参数、结合-解离曲线、传感器固定量、Rmax、拟合优度（R²/χ²）及详细实验报告，数据可直接用于论文发表和抗体药物申报。
服务流程
2
传感器选择与条件优化
选择合适传感器
优化固定量与缓冲液
3
配体固定与基线
传感器捕获/固定配体
缓冲液中平衡基线
6
数据分析与交付
全局拟合ka/kd/KD
实验报告交付
客户提供
样品与材料要求
配体样品（固定在传感器表面）：需提供用于固定在传感器表面的目标分子（蛋白、抗体、核酸、多肽、小分子等）。
▶ 蛋白/抗体配体：建议浓度≥50μg/mL（约0.5-5μM，视分子量而定），总量≥50μg，纯度≥80%；如为His标签蛋白推荐使用Anti-His或Ni-NTA传感器；如为抗体推荐使用Anti-Fc或Protein A/G传感器；
▶ 生物素化配体：如使用SA传感器，需提供生物素化的蛋白/核酸/多肽，生物素标记度建议1-3个/分子，需提供标记方法信息；
▶ 小分子配体：如使用AR2G传感器共价固定，需提供含伯胺的小分子或可生物素化的小分子，建议纯度≥95%；
▶ 核酸配体：建议使用SA传感器固定生物素化核酸，需提供退火后的双链或单链核酸，浓度≥1μM。
分析物样品（在溶液中流动结合）：
▶ 蛋白/抗体分析物：建议浓度≥100nM-10μM（根据预估KD调整，**高浓度建议为KD的10倍以上），总量≥100μg，需可溶于运行缓冲液；
▶ 小分子分析物：建议纯度≥95%，提供DMSO储备液（通常10-100mM），**终DMSO浓度≤1%（BLI对DMSO折射率变化敏感，需精确匹配DMSO浓度）；
▶ 粗样品（细胞培养上清/血清）：可直接提供原始样品，BLI可通过Anti-Fc等传感器特异性捕获目标抗体，无需纯化，但需说明样品基质和目标分子大致浓度；
▶ 需提供分析物的分子量、预估KD范围（如有文献参考），以指导浓度梯度设计（通常5-7个浓度，2倍或3倍稀释）。
缓冲液信息：需提供配体和分析物的储存缓冲液成分，以及推荐的运行缓冲液（常用PBS+0.02% Tween-20+0.1% BSA、HBS-EP+等）。BLI运行缓冲液建议添加0.02-0.05% Tween-20以减少非特异性吸附，添加0.1-0.5% BSA以封闭传感器表面。如样品含特殊成分（去垢剂、共因子、金属离子等），请提前说明。所有缓冲液和样品需使用同一缓冲液体系以避免折射率差异导致的体效应（Bulk Shift）。
实验信息：需提供配体和分析物名称、分子量、物种来源、标签信息（His/Fc/GST/生物素等）、预估KD范围、互作类型、传感器类型偏好（如不确定可由我方推荐）、实验目的（动力学测定/亲和力排序/表位分组/化合物筛选）、是否需要再生、温度要求（通常25-30°C）。如为抗体表位分组实验，需提供抗体列表和抗原信息。
服务说明
| 服务名称 | 服务内容 | 交付内容及标准 | 服务周期(工作日) |
|---|
| BLI + 亲和力动力学检测 | 传感器选择与条件优化 | 根据配体标签和性质选择合适传感器（SA/Anti-His/Anti-Fc/AR2G/Ni-NTA等），优化固定量、运行缓冲液、再生条件 | 12 |
| 配体固定与基线 | 传感器捕获/固定配体至目标固定量（通常0.5-2nm），缓冲液中平衡基线，设参考传感器对照 |
| 多浓度结合-解离检测 | 5-7个浓度梯度分析物（2倍或3倍稀释），每个浓度记录结合（60-300s）和解离（60-600s）曲线，全局拟合 |
| 再生与重复 | 优化再生条件（Glycine-HCl pH 1.5-2.5等），传感器可再生5-10次，完成所有浓度检测 |
| 数据分析与报告 | Octet Data Analysis软件全局拟合（1:1结合模型等），提供ka、kd、KD、Rmax、拟合优度R²/χ²、传感图及详细报告 |
| BLI + 抗体表征与表位分组 | 抗体捕获与条件建立 | Anti-Fc或Protein A/G传感器捕获抗体，优化捕获量和再生条件，建立抗体-抗原结合检测方法 | 15 |
| 亲和力排序与动力学 | 对多株抗体进行抗原结合动力学检测，获得各抗体的ka/kd/KD，按亲和力排序，筛选**优候选抗体 |
| 表位分组（Epitope Binning） | 采用三明治法或竞争法进行抗体表位分组：**抗体捕获抗原后，检测第二抗体能否同时结合，将抗体分为不同表位组 |
| 结果交付 | 提供各抗体动力学参数表、亲和力排序图、表位分组矩阵图、代表性传感图、抗体滴度/浓度测定结果及详细报告 |
| BLI + 小分子/片段化合物筛选 | 靶蛋白固定与方法建立 | 将靶蛋白固定在AR2G或SA传感器表面，优化固定量和缓冲液，建立阳性化合物对照的结合检测方法 | 18 |
| 化合物单浓度初筛 | 待测化合物单浓度（通常10-50μM，DMSO≤1%）与固定靶蛋白结合，BLI实时检测响应信号，设DMSO对照和阳性对照 |
| 阳性化合物体征确认 | 初筛阳性化合物进行5-7个浓度梯度BLI检测，拟合获得KD值，排除非特异性结合和聚集干扰 |
| 片段化合物筛选（可选） | 针对片段化合物库（分子量150-300Da），使用高固定量和高浓度（0.1-1mM）进行筛选，提高小分子检测灵敏度 |
| 结果交付 | 提供筛选原始数据、阳性化合物列表、KD值排序、剂量-响应曲线、代表性传感图、结合速率和解离速率分析及详细报告 |
案例展示
研究利用生物膜干涉（BLI）技术对从COVID-19康复患者中分离的200余株SARS-CoV-2中和抗体进行了高通量结合动力学表征和表位分组，为抗体鸡尾酒疗法的设计提供了关键依据。研究者使用Octet RED96e系统，采用Anti-Fc传感器（Anti-human IgG Fc）从杂交瘤细胞培养上清中直接捕获人源IgG抗体（无需纯化），然后与重组表达的SARS-CoV-2刺突蛋白RBD（受体结合域）进行结合动力学检测。BLI的8通道并行检测和96孔板格式使得研究者在短短两天内完成了全部200余株抗体的ka、kd、KD测定，每株抗体使用5个RBD浓度梯度（0.78-50nM，2倍稀释），结合时间120秒，解离时间300秒，全局1:1拟合。结果显示，中和抗体的KD值分布在0.1nM至500nM之间，其中高亲和力抗体（KD<1nM）的中和活性（IC50）普遍更强，但也发现部分中等亲和力抗体（KD=5-20nM）因靶向独特表位而具有强效中和能力，提示亲和力并非**决定因素。随后，研究者利用BLI进行了表位分组（Epitope Binning）实验：先在Anti-Fc传感器上捕获**株抗体，结合饱和浓度的RBD，然后加入第二株抗体检测其能否与RBD同时结合（三明治模式）。通过两两组合的竞争实验，将200余株抗体分为4个主要表位组（Group I-IV），分别对应RBD上的不同中和表位区域，其中Group I和Group II抗体靶向ACE2结合位点的不同亚区，Group III和Group IV抗体靶向RBD的非ACE2结合区域。BLI表位分组结果与后续冷冻电镜结构解析完全一致。基于BLI表位分组信息，研究者选择了来自不同表位组的两株高亲和力抗体（CB6来自Group I，C135来自Group IV）组成抗体鸡尾酒，体外中和实验显示该鸡尾酒组合不仅中和活性强于单抗体，还能有效规避SARS-CoV-2突变株（如N501Y、E484K）的免疫逃逸。该研究充分展示了BLI在抗体药物研发中的独特优势：可直接从细胞培养上清中捕获抗体进行高通量动力学筛选，无需纯化；8通道并行检测大幅缩短了抗体表征周期；表位分组功能为抗体组合设计提供了直接依据。该BLI数据与ELISA中和实验、假病毒中和实验和冷冻电镜结构结果一致。
研究利用生物膜干涉（BLI）技术定量检测了KRAS G12D突变体蛋白与一系列新型小分子抑制剂的结合动力学和亲和力，并揭示了小分子对KRAS不同核苷酸结合状态（GDP结合态vs GTP类似物结合态）的构象选择性。KRAS是人类癌症中**常见的突变癌基因之一，长期被认为是"不可成药"靶点，其表面缺乏传统的深疏水结合口袋。研究者将重组表达的KRAS G12D蛋白（含His标签）通过Ni-NTA传感器固定在Octet RED96e系统上，固定量控制在1.2nm以减少传质效应。将一系列针对Switch II口袋（Switch II Pocket）的共价和非共价小分子抑制剂作为分析物，进行5个浓度梯度（0.0625-1μM，2倍稀释）的BLI结合-解离检测，结合时间180秒，解离时间600秒。BLI结果显示，共价抑制剂MRTX1133与KRAS G12D GDP态的结合表现为典型的慢结合-慢解离动力学特征（ka=1.2×10⁴ M⁻¹s⁻¹，kd=3.5×10⁻⁵ s⁻¹，KD=2.9nM），解离半衰期超过5小时，与其共价结合机制一致；而非共价抑制剂的解离速率明显更快（kd=1-5×10⁻³ s⁻¹），KD在50-200nM范围。研究者进一步比较了小分子与KRAS G12D GDP态（非活性态）和GTPγS态（活性态）的结合差异，BLI结果显示MRTX1133对GDP态的KD为2.9nM，而对GTPγS态的KD为350nM，选择性超过100倍，证明该抑制剂优先结合KRAS的非活性构象，这一发现为理解KRAS抑制剂的作用机制提供了关键动力学证据。由于BLI无需微流控且传感器可再生，研究者在同一批Ni-NTA传感器上完成了超过50个小分子的结合动力学检测，每个传感器可再生使用8次以上，大幅降低了实验成本和珍贵重组蛋白的消耗。BLI还被用于检测KRAS与SOS1（鸟苷酸交换因子）和RAF-RBD（效应因子）的蛋白-蛋白相互作用，验证了小分子抑制剂对KRAS-效应因子结合的阻断效果。该研究展示了BLI在小分子药物发现中的独特优势：对小分子（分子量约300-500Da）的结合检测灵敏度足够；高通量格式适合化合物库的动力学筛选；无微流控设计避免了小分子在管路中的非特异性吸附和残留问题；传感器可再生重复使用降低成本。该BLI结果与SPR、ITC、X射线晶体学和细胞活性实验结果一致。
Q&A 常见问题
BLI与SPR有什么区别？应该如何选择？
BLI（生物膜干涉）和SPR（表面等离子共振）都是无标记、实时检测生物分子相互作用的光学技术，均可获得ka、kd、KD动力学参数，但原理和适用场景有明显差异：①检测原理：SPR通过金膜表面的等离子体共振角/波长变化检测折射率变化，BLI通过光纤尖端两层反射光的干涉光谱波长偏移检测生物膜层厚度变化；②检测格式：SPR使用微流控系统，样品持续流过芯片表面，BLI采用"浸入即读"模式，传感器直接浸入96/384孔板，无管路；③通量：SPR通常1-4通道（部分高通量型号8通道），BLI标准8通道、HTX型号16通道，且96/384孔板格式更适合自动化高通量；④灵敏度：SPR对小分子（<200Da）和极低亲和力的检测灵敏度通常更高，BLI对>300Da的小分子和蛋白互作灵敏度足够；⑤样品兼容性：BLI可直接检测细胞培养上清、血清等粗样品（通过特异性传感器捕获目标分子），SPR通常需要纯化样品以避免微流控堵塞；⑥操作维护：BLI无微流控，操作简单、维护成本低、无堵塞风险，SPR微流控需要定期维护和清洗；⑦温度控制：SPR密闭流路温度控制更精确（±0.01°C），BLI开放式孔板温度控制精度略低（±0.1°C）；⑧传质效应：SPR持续流动可减少传质限制，BLI静止孔中扩散限制可能影响快结合体系的ka精度。选择原则：需要高通量抗体筛选/表位分组/粗样品检测→BLI；需要**高灵敏度（极小小分子、极弱亲和力）或精确动力学→SPR；预算有限或操作简便优先→BLI；药物申报需要金标准动力学数据→SPR。两者经常互补使用：BLI用于高通量初筛和排序，SPR用于候选分子的精确动力学验证。
BLI有哪些传感器类型？如何选择？传感器可以重复使用吗？
BLI提供丰富的传感器类型以适配不同配体的固定需求，选择原则主要根据配体的标签和性质：①链霉亲和素传感器（SA, Streptavidin）：用于生物素化配体（生物素化蛋白、核酸、多肽、小分子），固定牢固均一，是**常用的传感器之一，适合有生物素标记的样品；②Anti-His传感器（Anti-Penta-His）：通过抗体特异性捕获His标签重组蛋白，条件温和不影响蛋白活性，固定量可控，适合His标签蛋白，但传感器不可再生（抗体-抗原结合较稳定）；③Ni-NTA传感器：通过金属螯合捕获His标签蛋白，可使用咪唑或EDTA再生，适合需要重复使用的场景，但固定量可能低于Anti-His；④Anti-Fc/Protein A/Protein G传感器：通过Fc段特异性捕获抗体，是抗体表征、表位分组和抗体滴度检测的**，可使用低pH再生，适合直接从细胞培养上清中捕获抗体；⑤氨基反应性传感器（AR2G, Amine Reactive 2nd Generation）：通过EDC/NHS化学将配体的伯胺共价偶联到传感器表面，适用于无标签蛋白、小分子和其他缺乏特异性标签的分子，固定牢固但可能影响蛋白活性；⑥Anti-GST传感器：用于GST标签蛋白的特异性捕获；⑦Biotin CAPture传感器：可可逆捕获生物素化分子，便于传感器再生和更换配体；⑧SAX强阴离子交换传感器：通过静电作用捕获带负电荷的分子（如核酸、酸性蛋白）。关于传感器重复使用：大部分传感器可通过再生（Regeneration）重复使用，再生液通常为10mM Glycine-HCl pH 1.5-2.5（低pH破坏非共价结合）、2M MgCl₂（高盐破坏静电相互作用）或10mM EDTA（螯合金属离子，用于Ni-NTA）。一般传感器可再生5-10次，但每次再生可能导致少量配体丢失，需监测固定量变化。Anti-His传感器因抗体-抗原结合稳定，通常不建议再生（一次性使用）；AR2G共价固定的传感器可再生使用但配体不可更换。南京高斯生物会根据实验需求推荐**合适的传感器类型，并优化再生条件以**大化传感器使用效率。
BLI可以检测哪些类型的分子互作？对分子量和亲和力有限制吗？
BLI可以检测多种类型的生物分子相互作用，包括：①蛋白质-蛋白质相互作用（受体-配体、酶-底物、信号通路蛋白、细胞因子-受体）；②抗体-抗原相互作用（中和抗体、治疗性抗体、抗体滴度、表位分组）；③蛋白质-小分子相互作用（药物靶点结合、抑制剂筛选、片段化合物筛选）；④蛋白质-核酸相互作用（转录因子-DNA、RNA结合蛋白-RNA）；⑤蛋白质-脂质/膜相互作用；⑥核酸-核酸相互作用（DNA杂交、miRNA靶向）；⑦蛋白质-多肽相互作用。关于分子量限制：BLI检测的是传感器表面生物膜层光学厚度变化（即结合质量变化），因此分析物分子量越大，信号越强。BLI对蛋白-蛋白互作（分子量通常>10kDa）的检测非常灵敏；对小分子分析物，一般建议分子量>300Da可获得可靠信号，分子量150-300Da的片段化合物需要较高固定量和较高分析物浓度才能检测；分子量<150Da的极小分子BLI检测较困难，建议使用SPR或ITC。通过使用高固定量（>2nm）、高分析物浓度（可达100μM-1mM）和延长结合时间，BLI可检测低至约150Da的片段化合物。关于亲和力范围：BLI可检测的KD范围通常为1pM到1mM，覆盖了从极高亲和力（pM级，如强效抗体）到弱亲和力（mM级，如片段化合物、弱蛋白互作）的广泛范围。对于极高亲和力（KD<1pM），解离极慢，解离曲线可能在实验时间内无法观察到明显下降，需延长解离时间或使用竞争法；对于极弱亲和力（KD>1mM），需要极高的分析物浓度可能导致溶解度或非特异性结合问题。总体而言，BLI的适用范围非常广泛，是抗体药物研发和蛋白互作研究中**常用的技术之一。
BLI实验需要多少样品？可以直接检测细胞培养上清或血清吗？
BLI的样品消耗量相对较低，具体用量取决于实验类型和传感器类型：①配体样品（固定在传感器上）：蛋白配体通常需要50-100μg（浓度50-200μg/mL，体积100-500μL），如果传感器可再生重复使用，实际消耗更低；抗体配体如使用Anti-Fc传感器从细胞培养上清中直接捕获，则无需纯化抗体，仅需50-200μL细胞培养上清；②分析物样品（溶液中结合）：每个浓度需要约200μL（96孔板单孔体积），5-7个浓度共需1-1.5mL，总蛋白量约50-200μg；小分子分析物每个浓度约200μL，总化合物量约0.1-1mg。关于粗样品检测：BLI的一个显著优势是可以直接检测细胞培养上清、血清、血浆、细胞裂解液等粗样品中的目标分子，无需纯化。这是因为BLI使用特异性传感器（如Anti-Fc传感器特异性捕获IgG抗体、Anti-His传感器特异性捕获His标签蛋白），只有目标分子被捕获到传感器表面，其他杂质蛋白不会产生信号。例如在抗体药物研发中，可直接将杂交瘤或CHO细胞培养上清加入孔板，用Anti-Fc传感器捕获其中的抗体，然后检测与抗原的结合动力学，整个过程无需抗体纯化，大大缩短了抗体筛选周期。在血清样品中，也可通过Anti-Fc或Protein A传感器捕获总IgG进行抗体滴度或亲和力检测。但粗样品检测需注意：①样品中目标分子浓度不能过低（建议>1μg/mL），否则捕获量不足；②粗样品中的蛋白酶可能降解目标蛋白，建议添加蛋白酶抑制剂；③高浓度血清蛋白可能导致非特异性吸附，需在缓冲液中添加BSA和Tween-20封闭，并设置参考传感器扣除背景；④DMSO和其他有机溶剂在粗样品中需控制浓度（≤1%）以避免折射率干扰。南京高斯生物在BLI实验前会评估样品类型和浓度，推荐**优的检测方案。
BLI数据如何分析？如何判断动力学数据的质量？拟合模型如何选择？
BLI数据分析使用Octet Data Analysis软件（或第三方软件如TraceDrawer、Scrubber），基本流程包括：①数据预处理：对原始传感图进行Y轴对齐（以结合前基线为零点）、X轴对齐（以结合起始点为零点）、参考传感器扣除（减去空白传感器的非特异性信号）、空白缓冲液扣除（减去体效应Bulk Shift）；②结合-解离曲线拟合：对不同分析物浓度的曲线进行全局拟合（Global Fitting），同时拟合所有浓度的结合相和解离相，获得ka、kd和KD（KD=kd/ka）；③拟合模型选择：**常用的是1:1结合模型（Langmuir模型），适用于配体和分析物均为单价、单位点结合的简单体系；如果配体表面存在异质性（如固定导致部分蛋白变性），可使用2:1异质配体模型（2:1 Heterogeneous Ligand）；如果分析物是双价（如IgG抗体有两个抗原结合位点），可使用双价分析物模型（Bivalent Analyte）；如果存在明显的传质限制（Mass Transport），可使用包含传质系数的模型；④质量评估：拟合后需评估数据质量，关键指标包括：R²（决定系数，越接近1越好，通常>0.95）、χ²（残差平方和，越小越好）、残差图（Residuals，应随机分布在零线附近，无系统性偏差）、KD值应在浓度梯度范围内（不应低于**低浓度或高于**高浓度太多）、Rmax（**大响应值）应合理（与配体固定量和分析物分子量成正比）、不同浓度曲线应呈现典型的浓度依赖性（浓度越高结合越快、响应越高）。判断数据质量的常见问题：①如果结合曲线在高浓度下不达到平台（不饱和），说明**高浓度不够，需提高浓度范围；②如果解离曲线下降过快或过慢，可能是浓度范围不合适或非特异性结合；③如果不同浓度曲线重叠或无浓度依赖性，可能是配体固定失败或分析物无活性；④如果残差图呈现系统性趋势（如所有曲线在结合初期正偏差、后期负偏差），说明拟合模型不合适，需尝试2:1模型或考虑传质效应；⑤如果ka值异常高（>10⁷ M⁻¹s⁻¹），可能存在传质限制，需降低配体固定量或提高搅拌速度。南京高斯生物在交付BLI数据时会提供完整的拟合参数、残差分析和数据质量评估，确保结果可靠可发表。
