服务介绍
微量热泳动（Microscale Thermophoresis，MST）是由德国NanoTemper Technologies公司开发的一种基于热泳动效应的生物分子相互作用定量检测技术，由Braun等人于2000年代初期建立，目前已成为研究生物分子亲和力的重要方法。其核心原理是：在充满样品溶液的毛细管中，通过红外激光（IR Laser）局部加热产生一个精确的微观温度梯度（ΔT约2-6°C），溶液中的分子会沿温度梯度发生定向迁移（即热泳动，Thermophoresis），从高温区域向低温区域移动，导致加热点处荧光标记分子的浓度降低、荧光强度下降。分子的热泳动行为（即Soret系数）由其分子大小、表面电荷和水化层厚度共同决定，当荧光标记的目标分子与配体发生结合时，复合物的大小、电荷或水化层发生改变，导致热泳动速率发生变化，表现为加热点处荧光强度变化的幅度和速率不同。通过将归一化荧光信号（Fnorm，通常取加热后某一时刻的荧光值与初始荧光值的比值）对配体浓度的对数作图，拟合得到剂量-响应结合曲线，曲线拐点处对应的配体浓度即为平衡解离常数KD。
MST实验的基本流程包括：①荧光标记（Fluorescent Labeling）：将目标分子（通常为蛋白）进行荧光标记，常用标记方式包括NHS酯标记（标记赖氨酸伯胺，如NT-647-NHS、NT-495-NHS染料）、His标签标记（Tris-NTA偶联染料，特异性结合His标签蛋白）、半胱氨酸标记（马来酰亚胺染料）以及荧光蛋白融合（GFP/YFP/mCherry融合表达，无需化学标记，可直接在细胞裂解液中检测）；对于有色氨酸的蛋白也可使用免标记模式（Monolith LabelFree，检测内源色氨酸荧光）。②配体梯度稀释：将未标记的配体（分析物）进行16个浓度的系列稀释（通常2倍或3倍稀释），浓度范围覆盖预估KD的10倍以上到10倍以下。③混合与孵育：将等量的荧光标记目标分子分别与不同浓度的配体混合，室温孵育达到结合平衡。④毛细管装样：将16个混合样品分别装入标准毛细管或Premium涂层毛细管（减少吸附）。⑤MST检测：将毛细管放入仪器，依次检测每个样品的初始荧光（冷态）和红外激光加热后的荧光变化（热泳动信号），通常MST Power选择中高功率，LED Power根据荧光强度优化。⑥数据分析：使用MO.Control或MO.Affinity分析软件，对Fnorm与配体浓度进行拟合（通常使用1:1结合模型或Kd模型），获得KD值及拟合质量参数。MST的核心优势在于完全在自由溶液中进行，无需将分子固定在表面，避免了固定化导致的活性损失和空间位阻问题，且样品用量极低（每个毛细管仅需4-10μL，总样品量可低至微克级），可在复杂缓冲液（含去垢剂、共因子、高盐等）甚至细胞裂解液中直接检测，特别适合膜蛋白、大分子复合物和难纯化蛋白。MST的局限性在于：只能获得平衡亲和力KD，无法获得结合速率ka和解离速率kd等动力学参数；对缓冲液中的自发荧光成分（如高浓度DMSO、某些培养基成分）和高浓度去垢剂敏感；需要对目标分子进行荧光标记或具有内源荧光。MST实验需设置对照确保数据可靠：荧光标记效率验证（标记度DOL应在0.3-1.0之间）、目标蛋白单独存在的热泳动基线、已知互作对的阳性对照、无关蛋白或缓冲液的阴性对照，以及通过改变MST Power和LED Power验证信号的稳定性。
\图：微量热泳动（Microscale Thermophoresis，MST）实验原理与操作流程
服务优势
🧪
无需固定化溶液中检测
完全在自由溶液中进行，无需将分子固定在芯片或传感器表面，避免了固定化导致的蛋白活性损失、空间位阻和取向问题，**大程度保留分子天然构象。
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样品用量极少
每个检测仅需4-10μL样品，总蛋白量可低至数微克，适合珍贵样品、膜蛋白、低表达蛋白和难纯化蛋白的互作研究，是目前样品消耗**低的互作技术之一。
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适用范围广条件灵活
可在含去垢剂、共因子、高盐、DMSO等复杂缓冲液中检测，甚至可在细胞裂解液中直接检测GFP融合蛋白；KD检测范围覆盖nM至mM级，适合各类强弱互作。
📊
交付内容完整
提供荧光标记结果、标记效率检测、原始MST热泳动曲线、归一化结合曲线、KD拟合值、拟合质量参数及详细实验报告，可直接用于论文发表。
服务流程
1
接收订单及样品
确认实验方案
接收目标蛋白/配体样品
2
荧光标记与条件优化
选择标记方式
优化MST/LED功率
3
配体梯度稀释与混合
16个浓度系列稀释
与标记蛋白混合孵育
客户提供
样品与材料要求
目标蛋白（荧光标记对象）：需提供用于荧光标记的目标分子（通常为蛋白、抗体、核酸等）。
▶ 蛋白样品：建议浓度≥5μM（约0.1-1mg/mL，视分子量而定），总量≥20μg，纯度≥85%；
▶ 需提供样品的缓冲液成分（避免含高浓度伯胺如Tris、甘氨酸，会干扰NHS标记；避免含还原剂如DTT，会干扰马来酰亚胺标记）；
▶ 如为His标签蛋白，可使用Tris-NTA染料标记，无需去除咪唑（≤50mM）；
▶ 如为GFP/YFP融合蛋白，可免化学标记直接检测，需确认荧光蛋白的表达和折叠正常。
配体/分析物（未标记）：
▶ 蛋白/多肽配体：建议浓度≥100μM，总量≥50μg，需可溶于运行缓冲液；
▶ 小分子配体：建议纯度≥95%，提供DMSO储备液（通常10-100mM），**终DMSO浓度≤5%；
▶ 核酸配体：建议浓度≥100μM，提供序列信息和退火条件；
▶ 需提供配体的分子量、预估KD范围（如有文献参考），以指导浓度梯度设计。
缓冲液信息：需提供目标蛋白和配体的储存缓冲液成分，以及推荐的运行缓冲液（如PBS、HBS、Tris缓冲液等，含0.05% Tween-20可减少吸附）。如样品含特殊成分（去垢剂如DDM、共因子如ATP/GTP、金属离子等），请提前说明，MST可兼容大多数缓冲液成分。
实验信息：需提供目标分子和配体名称、分子量、物种来源、预估KD范围、互作类型（蛋白-蛋白/蛋白-小分子/蛋白-核酸等）、标记方式偏好（NHS/His-tag/GFP融合/免标记）、是否需要阳性/阴性对照、温度要求（通常22-25°C室温）。如为化合物筛选，需提供化合物列表和浓度范围。
服务说明
| 服务名称 | 服务内容 | 交付内容及标准 | 服务周期(工作日) |
|---|
| MST + 亲和力检测（化学标记） | 荧光标记与效率检测 | NHS酯或His-tag荧光标记目标蛋白，检测标记度（DOL 0.3-1.0），去除游离染料 | 12 |
| 检测条件优化 | 优化LED Power（荧光强度）和MST Power（加热功率），测试毛细管吸附情况，选择标准或Premium毛细管 |
| 配体梯度滴定 | 16个浓度梯度（2倍或3倍稀释）配体与标记蛋白混合孵育，设阳性对照和阴性对照 |
| MST检测 | Monolith仪器检测16个样品的初始荧光和热泳动信号，每个浓度1次检测，必要时重复 |
| 数据分析与报告 | MO.Affinity软件拟合结合曲线，计算KD值，提供原始热泳动曲线、结合曲线图、KD值及拟合质量参数 |
| MST + 免标记/GFP融合检测 | 样品评估 | 评估目标蛋白内源色氨酸荧光强度（免标记模式）或GFP/YFP融合蛋白表达水平，确定检测可行性 | 10 |
| 检测条件优化 | 优化激发光功率和MST功率，测试缓冲液背景荧光，选择合适检测参数 |
| 配体梯度滴定与检测 | 16个浓度梯度配体与目标蛋白（免标记或GFP融合）混合孵育，MST检测热泳动信号 |
| 数据分析与报告 | 拟合结合曲线计算KD，提供原始曲线、结合图、KD值及详细实验报告，无需化学标记步骤 |
| MST + 化合物库筛选 | 目标蛋白标记与条件建立 | 荧光标记目标蛋白，优化MST检测条件，建立阳性化合物对照的KD检测方法 | 18 |
| 化合物单浓度初筛 | 待测化合物单浓度（通常10-50μM）与标记蛋白混合，MST检测热泳动信号变化，设DMSO对照和阳性对照 |
| 阳性化合物体征确认 | 初筛阳性化合物进行16个浓度梯度MST检测，拟合获得KD值，排除假阳性和聚集干扰 |
| 正交验证（可选） | 对排名靠前的化合物可通过SPR或ITC进行正交验证，确认结合特异性 |
| 结果交付 | 提供筛选原始数据、阳性化合物列表、KD值排序、剂量-响应曲线、热泳动代表性曲线及详细实验报告 |
案例展示
研究利用微量热泳动（MST）技术定量检测了转录因子STAT3（信号转导与转录激活因子3）与其靶基因启动子DNA序列的结合亲和力，并揭示了STAT3酪氨酸磷酸化（pY705）对DNA结合活性的调控机制。STAT3是炎症和肿瘤中的关键转录因子，其SH2结构域介导的二聚化和C端酪氨酸磷酸化是其核转位和DNA结合的前提。研究者将重组表达的STAT3蛋白（包含DNA结合结构域和SH2结构域）通过NT-647-NHS染料进行氨基标记（标记度DOL=0.6），将不同长度和序列的生物素化DNA探针（来自SOCS3、MYC、Bcl-xL等STAT3靶基因启动子）作为未标记配体进行16个浓度梯度滴定（0.1nM至10μM，3倍稀释），在含50mM NaCl和1mM DTT的Tris缓冲液中进行MST检测。结果显示，STAT3与SOCS3启动子的高亲和力SIE元件（m67序列）结合的KD为12.5nM，而与突变型SIE元件（核心碱基GAS突变为AAS）的KD为2.3μM，亲和力下降约184倍，证明了STAT3 DNA结合的序列特异性。进一步比较了未磷酸化STAT3和体外磷酸化STAT3（pY705）的DNA结合亲和力，MST结果显示pY705-STAT3与m67 DNA的KD为3.8nM，比未磷酸化STAT3（KD=12.5nM）高约3.3倍，证明酪氨酸磷酸化显著增强STAT3的DNA结合活性。研究者还利用MST检测了STAT3与不同长度DNA片段的结合，发现STAT3优先结合含两个连续GAS元件的串联重复序列（KD=1.2nM），提示STAT3二聚体与DNA的协同结合模式。由于MST完全在溶液中进行且样品用量极少，研究者成功检测了从HEK293T细胞中免疫沉淀纯化的内源性STAT3（仅约5μg总蛋白）与DNA的结合，获得了与重组蛋白一致的KD值。该研究同时通过EMSA和ChIP-qPCR验证了MST结果的可靠性。该研究展示了MST在转录因子-DNA互作定量分析中的独特优势，特别是在样品量极少和需要检测翻译后修饰影响的研究场景中。
研究利用微量热泳动（MST）技术在含去垢剂的溶液环境中定量检测了G蛋白偶联受体（GPCR）β2肾上腺素能受体（β2AR）与一系列配体小分子的结合亲和力，并区分了激动剂、拮抗剂和反向激动剂对受体不同构象状态的选择性。β2AR是典型的七次跨膜GPCR，其纯化和活性维持需要在去垢剂（如DDM、LMNG）或纳米盘（Nanodisc）环境中进行，传统的SPR和ITC技术在膜蛋白检测中常因固定化导致活性损失或样品用量过大而受限。研究者将纯化的β2AR（在0.1% DDM/0.02% CHS去垢剂缓冲液中）通过NT-647马来酰亚胺染料标记其胞内端的半胱氨酸残基（标记度DOL=0.4），将一系列β2AR配体（包括激动剂异丙肾上腺素、拮抗剂普萘洛尔、反向激动剂卡维地洛等共12种化合物）作为未标记配体进行MST检测。由于MST可兼容去垢剂缓冲液，且每个样品仅需5μL（含约50nM标记受体，总量仅约2μg受体蛋白），研究者成功获得了所有配体的KD值。结果显示，β2AR与激动剂异丙肾上腺素的KD为1.2μM，与拮抗剂普萘洛尔的KD为45nM，与反向激动剂卡维地洛的KD为12nM，与文献报道的放射性配体结合实验结果高度一致（R²=0.94）。进一步通过MST检测了配体与G蛋白预结合的β2AR-Gs复合物的亲和力，发现激动剂对Gs结合态受体的亲和力提高约10倍（KD从1.2μM降至0.13μM），而拮抗剂和反向激动剂的亲和力不受Gs结合影响，这一结果直接反映了配体对受体活性构象（R*态）的选择性，为理解GPCR药物的偏向性激动提供了定量依据。研究者还利用MST进行了片段化合物库（96个片段）的单浓度初筛，发现了3个新的β2AR结合片段，KD范围为5-50μM，并通过X射线晶体学验证了其中一个片段的结合位点。该研究展示了MST在膜蛋白-小分子互作检测中的独特优势，特别是在需要维持去垢剂环境和样品极其珍贵的GPCR研究中，MST是比SPR和ITC更实用的选择。该MST结果与放射性配体结合实验、SPR和分子动力学模拟结果一致。
Q&A 常见问题
MST与SPR、ITC、BLI有什么区别？应该如何选择？
这四种技术都是无标记（或MST需一个分子标记）检测生物分子相互作用的常用方法，但原理和适用场景各有不同：①MST（微量热泳动）：在自由溶液中通过红外激光产生温度梯度，检测分子热泳动行为变化，完全无需固定化，样品用量极低（μL级/μg级），可兼容复杂缓冲液和去垢剂，适合膜蛋白和难纯化蛋白，但只能获得KD不能获得ka/kd动力学，且需要荧光标记（或内源荧光）；②SPR（表面等离子共振）：配体固定在金膜芯片表面，分析物流过，实时检测折射率变化，获得ka、kd、KD，灵敏度高，是动力学金标准，但需要固定化（可能影响活性），样品用量比MST大；③ITC（等温滴定量热法）：在溶液中直接测量结合产生的热量，获得KD、化学计量比（n）、焓变（ΔH）和熵变（ΔS），完全无需标记和固定，但样品用量大（数百微克）、耗时长、不适合弱亲和力和高通量；④BLI（生物膜干涉，如Octet）：与SPR类似但使用光纤传感器，可同时检测8-96个样品，通量高，操作简单，但动力学精度和灵敏度略低于SPR。选择原则：样品极少（μg级）或膜蛋白/难纯化蛋白→MST；需要精确ka/kd动力学→SPR；需要热力学参数（ΔH/ΔS）→ITC；需要高通量筛选（96通道）→BLI。对于珍贵样品和膜蛋白，MST通常是**初筛方法，阳性结果再用SPR或ITC验证。
MST需要荧光标记吗？有哪些标记方式？标记会影响蛋白活性吗？
MST需要检测荧光信号，因此目标分子需要具有可检测的荧光，主要有以下几种方式：①NHS酯标记（**常用）：NHS活化的荧光染料（如NT-647-NHS、NT-495-NHS）与蛋白表面赖氨酸的伯胺共价结合，适用于大多数蛋白，标记操作简单，但标记是随机的，可能标记到蛋白的功能位点；②His-tag标记（Tris-NTA染料）：Tris-NTA偶联的荧光染料特异性结合蛋白的His标签，标记均一、可逆、条件温和，适合重组表达的His标签蛋白，是推荐的标记方式；③半胱氨酸标记（马来酰亚胺染料）：马来酰亚胺染料与蛋白的游离半胱氨酸巯基共价结合，适合表面有游离半胱氨酸的蛋白，标记位点更可控；④荧光蛋白融合（GFP/YFP/mCherry）：将目标蛋白与荧光蛋白融合表达，无需化学标记，可直接在细胞裂解液中检测，特别适合难纯化蛋白和内源性蛋白，但荧光蛋白体积较大（约27kDa）可能影响目标蛋白的功能；⑤免标记模式（LabelFree）：利用蛋白内源色氨酸的紫外荧光（激发280nm/发射350nm），完全无需标记，但灵敏度较低，要求蛋白浓度较高且缓冲液无紫外吸收成分。关于标记对蛋白活性的影响：化学标记确实可能影响蛋白活性，因此需控制标记度（DOL，Degree of Labeling）在0.3-1.0之间（即每个蛋白分子平均结合0.3-1个染料分子），避免过度标记。标记后需通过功能实验（如酶活、已知配体结合）验证蛋白活性是否保留。推荐优先使用位点特异性标记（如His-tag标记、定点半胱氨酸标记）或荧光蛋白融合，以**大程度减少对蛋白活性的影响。如果标记后蛋白活性丧失，可尝试更换标记方式、降低染料比例、或使用免标记模式。
MST可以检测哪些类型的分子互作？对分子量和亲和力有限制吗？
MST可以检测几乎所有类型的生物分子相互作用，包括：①蛋白质-蛋白质相互作用（如受体-配体、酶-底物、信号通路蛋白复合物、抗体-抗原）；②蛋白质-小分子相互作用（药物靶点结合、化合物筛选、片段化合物筛选）；③蛋白质-核酸相互作用（转录因子-DNA、RNA结合蛋白-RNA、核酸酶-底物）；④蛋白质-脂质/膜相互作用；⑤核酸-核酸相互作用（DNA-DNA、DNA-RNA杂交）；⑥蛋白质-离子/辅因子相互作用（如金属离子结合、ATP结合）；⑦酶-抑制剂相互作用。关于分子量限制：MST检测的是热泳动行为变化（由大小、电荷、水化层变化引起），而非直接的质量变化，因此对分析物的分子量没有严格下限。即使是很小的配体（如分子量100-500Da的小分子药物）与大蛋白结合，虽然大小变化不显著，但结合通常会引起蛋白水化层和电荷的变化，MST仍能检测到信号变化。MST已成功检测分子量低至几十道尔顿的离子（如Ca²⁺、Mg²⁺）与蛋白的结合。关于亲和力范围：MST可检测的KD范围通常为1nM到1mM，覆盖了从高亲和力（nM级，如抗体-抗原）到弱亲和力（mM级，如弱蛋白-蛋白互作、片段化合物）的广泛范围。对于极强亲和力（KD<1nM），由于结合接近饱和且解离极慢，MST检测精度有限，可考虑使用SPR或KinITC；对于极弱亲和力（KD>1mM），需要极高的配体浓度可能导致溶解度或缓冲液兼容性问题。总体而言，MST的亲和力检测范围非常宽，是目前适用范围**广的互作技术之一。
MST结果如何分析？只能得到KD吗？如何判断数据质量？
MST数据分析的基本流程：①原始数据是每个毛细管的荧光强度随时间变化曲线（包含冷态初始荧光、红外激光加热后的热泳动信号、激光关闭后的恢复信号）；②选择合适的时间点（通常加热后5-15秒，称为MST Trace）计算归一化荧光Fnorm（Fnorm = Fhot/Fcold × 1000，单位‰）；③将Fnorm对配体浓度的对数作图，得到剂量-响应散点图；④使用结合模型拟合曲线，**常用的是1:1结合模型（Kd模型），拟合得到KD值；⑤评估拟合质量：包括R²值（越接近1越好，通常>0.9）、曲线是否呈现典型的S型（从低平台到高平台或反之）、数据点是否均匀分布在拟合曲线两侧。MST主要提供平衡解离常数KD，这是其**核心的输出参数。与SPR不同，MST不能直接获得结合速率常数ka和解离速率常数kd，因为MST检测的是平衡态下的热泳动信号，而非实时的结合/解离动力学。不过，通过特殊的实验设计（如时间分辨MST，在混合后不同时间点检测），可以间接估算结合动力学，但这不是MST的常规应用。判断MST数据质量的关键指标：①初始荧光稳定性：所有毛细管的初始荧光（冷态）应相对一致（CV<10%），如果差异大可能是蛋白吸附、聚集或标记不均匀；②热泳动曲线形态：加热后荧光应平滑下降（或上升），无尖峰、跳变或异常波动；③剂量-响应关系：Fnorm应随配体浓度增加呈现单调变化（上升或下降），且有明显的平台区（低浓度和高浓度端），如果没有平台说明浓度范围不够；④拟合优度：R²>0.9，残差随机分布，KD值在浓度梯度范围内（KD不应低于**低浓度或高于**高浓度太多）；⑤可重复性：独立重复实验的KD值差异应在2倍以内。如果数据质量不达标，需优化条件（如更换缓冲液、降低去垢剂浓度、优化标记方式、调整浓度梯度范围、使用Premium涂层毛细管减少吸附）后重新检测。
MST对样品和缓冲液有什么要求？哪些成分会干扰MST检测？
MST对样品的要求相对宽松，但仍有一些需要注意的事项：①目标蛋白样品：建议纯度≥85%，浓度≥5μM（NHS标记需要约1-5μM，His-tag标记可低至50nM），总量≥20μg（实际消耗约5-10μg）；蛋白应无明显聚集（可通过动态光散射DLS或SEC验证），聚集会导致热泳动信号异常和蛋白吸附；②配体样品：需可溶于运行缓冲液，小分子化合物建议用DMSO配制储备液，**终DMSO浓度≤5%（高浓度DMSO会产生背景荧光和折射率干扰）；蛋白配体建议浓度≥100μM以确保能覆盖KD的10倍以上浓度。缓冲液兼容性：MST可兼容大多数常规缓冲液（PBS、HBS、Tris、HEPES等）、盐（NaCl≤1M）、去垢剂（DDM、LMNG、Tween-20、Triton X-100等，浓度≤0.5%）、共因子（ATP、GTP、金属离子等），甚至可以在细胞裂解液中直接检测GFP融合蛋白。可能干扰MST检测的成分包括：①高自发荧光物质：如高浓度DMSO（>5%）、某些培养基成分（如酚红）、核甘酸（高浓度ATP/ADP在紫外通道有吸收）、某些有色化合物，这些会增加背景荧光降低信噪比；②高浓度去垢剂（>1%）：可能改变溶液的热物理性质和分子热泳动行为，也可能导致蛋白去垢剂复合物的信号干扰；③强还原剂（DTT>5mM、β-巯基乙醇）：会干扰马来酰亚胺标记，且高浓度可能影响荧光染料稳定性；④高浓度甘油（>10%）：会显著改变溶液粘度和热扩散性质，影响热泳动信号；⑤气泡和颗粒：会导致毛细管内荧光不均匀，产生异常信号。建议在MST检测前将样品离心（10000g, 10min, 4°C）去除沉淀和聚集体，并用合适的缓冲液（如含0.05% Tween-20的PBS）稀释以减少非特异性吸附。南京高斯生物在MST实验前会对样品和缓冲液进行兼容性评估，确保检测条件**优。
