服务介绍
表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）是一种基于金属-介质界面光学效应的生物传感技术，由Liedberg等人于1983年首次应用于生物分子相互作用检测，目前已成为定量研究生物分子相互作用的"金标准"技术。其核心原理是：当偏振光以特定角度通过玻璃棱镜照射到金膜（或银膜）表面时，光子与金膜表面的自由电子发生耦合，激发表面等离子体波（Surface Plasmon Wave），在特定入射角（共振角）下反射光强度显著衰减。共振角对金膜表面附近（约200nm深度内）的折射率变化极为敏感，当生物分子结合到金膜表面时，局部质量增加导致折射率变化，共振角发生偏移，仪器将这种偏移转化为响应信号（Response Unit，RU，1RU≈1pg/mm²的质量变化），实时记录为传感图（Sensorgram）。
SPR实验的基本流程包括：①配体固定化（Ligand Immobilization）：将一种分子（配体，Ligand）通过化学方法固定在传感芯片表面，常用固定方法包括氨基偶联（Amine Coupling，使用EDC/NHS活化羧基葡聚糖基质）、生物素-链霉亲和素捕获（SA芯片）、Ni-NTA捕获（His标签蛋白，NTA芯片）、抗体捕获（Protein A/G芯片）等；②基线建立：运行缓冲液持续流过芯片表面，建立稳定的基线信号；③结合相（Association Phase）：将不同浓度的分析物（Analyte）溶液依次注入流动池，分析物与固定配体结合，RU信号实时上升；④解离相（Dissociation Phase）：切换回运行缓冲液，分析物从配体上解离，RU信号实时下降；⑤再生（Regeneration）：使用再生缓冲液（如甘氨酸-HCl pH 1.5-2.5、NaOH、MgCl₂等）洗脱仍结合在配体上的分析物，使芯片表面恢复初始状态，可重复使用。通过对多个浓度的传感图进行全局拟合（Global Fitting），可获得结合速率常数ka（kon，单位M⁻¹s⁻¹）、解离速率常数kd（koff，单位s⁻¹）和平衡解离常数KD（KD = kd/ka，单位M），KD值越小表示亲和力越强。SPR实验必须设置严格的对照以确保数据可靠性：参比流动池（Reference Flow Cell，通常Fc1不固定配体或固定无关蛋白）用于扣除非特异性结合和缓冲液折射率差异；空白进样（Buffer Blank）用于扣除系统漂移；双参比校正（Double Referencing）将参比池信号和空白进样信号从样品信号中扣除，获得真实的特异性结合信号。此外需通过1:1结合模型、二价结合模型或稳态亲和力模型等进行动力学拟合，评估拟合质量（Chi²值、残差分布）。SPR适用于检测蛋白质-蛋白质、抗体-抗原、蛋白质-小分子、蛋白质-核酸、蛋白质-脂质等多种生物分子相互作用，是药物发现、抗体表征和基础研究中不可或缺的核心技术。
图：表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）实验原理与操作流程
服务优势
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无标记实时检测
无需对分子进行荧光、同位素或酶标记，**大程度保留生物分子的天然构象和活性；实时记录结合和解离全过程，动态反映互作动力学。
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精准动力学与亲和力
同时获得ka（结合速率）、kd（解离速率）和KD（亲和力）三个关键参数，定量精度高，KD检测范围可覆盖pM至mM级，是分子互作定量的金标准。
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样品用量少可重复
单次检测仅需微克级蛋白和纳摩尔级小分子，芯片可重复再生使用数十次；微流控系统自动进样，通量高，适合化合物库筛选。
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交付内容完整
提供配体固定化结果、原始传感图、双参比校正后传感图、动力学拟合曲线、ka/kd/KD参数表、拟合质量评估（Chi²/残差）及详细实验报告。
服务流程
3
基线建立与条件优化
运行缓冲液平衡
优化流速/温度/再生条件
4
分析物梯度进样
5-7个浓度梯度进样
实时记录结合相传感图
5
解离与再生
缓冲液冲洗记录解离相
再生缓冲液洗脱复用芯片
6
动力学拟合与交付
双参比校正+全局拟合
ka/kd/KD分析报告交付
客户提供
样品与材料要求
配体样品（Ligand）：需提供用于固定在芯片表面的分子（通常为蛋白、抗体、核酸等）。
▶ 蛋白样品：建议浓度≥0.5mg/mL，总量≥50μg，纯度≥90%（SDS-PAGE或HPLC验证）；
▶ 需提供样品的缓冲液成分（避免含高浓度甘油、DMSO、EDTA等干扰固定的成分）；
▶ 如为生物素化蛋白或His标签蛋白，请说明标记效率或标签位置。
分析物样品（Analyte）：
▶ 蛋白/抗体分析物：建议浓度≥1mg/mL，总量≥100μg，需可溶于运行缓冲液；
▶ 小分子分析物：建议纯度≥95%，提供DMSO储备液（通常10mM），需说明**大可溶浓度；
▶ 需提供分析物的分子量、预估KD范围（如有文献参考），以指导浓度梯度设计。
缓冲液信息：需提供配体和分析物的储存缓冲液成分，以及推荐的运行缓冲液（如HBS-EP+：10mM HEPES pH7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% P20）。如样品含特殊成分（如去垢剂、共因子），请提前说明。
实验信息：需提供配体和分析物名称、分子量、物种来源、预估KD范围、互作类型（蛋白-蛋白/抗体-抗原/蛋白-小分子等）、是否需要特异性对照（如突变体、无关蛋白）、温度要求（通常25°C）、所需动力学参数。如为小分子筛选，需提供化合物列表和浓度范围。
服务说明
| 服务名称 | 服务内容 | 交付内容及标准 | 服务周期(工作日) |
|---|
| SPR + 亲和力动力学检测 | 配体固定化条件优化 | 选择合适芯片（CM5/SA/NTA等）和固定方法，优化固定水平（通常1000-5000RU），测定固定效率 | 15 |
| 运行条件优化 | 优化运行缓冲液、流速（通常30μL/min）、温度，测试再生条件确保芯片可重复使用 |
| 多浓度动力学检测 | 5-7个浓度梯度分析物进样（含空白进样），记录结合相和解离相传感图，设参比流动池 |
| 数据处理与拟合 | 双参比校正（参比池+空白扣除），1:1 Langmuir结合模型全局拟合，计算ka、kd、KD，评估Chi²和残差 |
| 结果交付 | 提供原始传感图、校正后传感图、拟合曲线图、ka/kd/KD参数表、拟合质量评估及详细实验报告 |
| SPR + 小分子互作筛选 | 配体固定化 | 靶蛋白固定于CM5或SA芯片，优化固定水平，确保蛋白活性保留 | 20 |
| 筛选条件建立 | 优化运行缓冲液（控制DMSO≤5%）、DMSO校正曲线、再生条件，确定Z'因子 |
| 化合物单浓度初筛 | 待测化合物单浓度（通常10μM）进样筛选，设DMSO对照和阳性化合物对照，计算结合响应 |
| 阳性化合物体征确认 | 初筛阳性化合物进行浓度梯度（5-7个浓度）进样，动力学拟合获得KD值，排除非特异性结合 |
| 结果交付 | 提供筛选原始数据、阳性化合物列表、剂量-响应曲线、KD值排序、DMSO校正及详细实验报告 |
| SPR + 抗体亲和力表征 | 抗原固定化 | 抗原固定于CM5芯片（氨基偶联）或SA芯片（生物素化抗原），优化固定水平 | 18 |
| 抗体动力学检测 | 不同浓度抗体（通常nM范围）进样，记录结合和解离相，评估抗体的结合速率和解离速率 |
| 多批次/多克隆比较 | 可同时比较多株抗体或多批次抗体的亲和力差异，提供KD排序和动力学参数对比 |
| 特异性与交叉反应 | 测试抗体与同源蛋白、突变体或不同物种同源蛋白的交叉反应性，评估特异性 |
| 结果交付 | 提供各抗体传感图、拟合曲线、ka/kd/KD参数对比表、特异性分析及详细实验报告，可直接用于抗体申报 |
案例展示
研究利用Biacore T200表面等离子共振（SPR）系统精确测定了一系列抗PD-1单克隆抗体与人PD-1蛋白的亲和力和动力学参数，并基于动力学特征指导抗体药物的亲和力成熟和功能优化。研究者将重组人PD-1蛋白通过氨基偶联固定在CM5传感芯片表面（固定水平约2000RU），将不同克隆的抗PD-1抗体以5个浓度梯度（0.78nM至50nM，3倍稀释）依次注入流动池，结合相180秒，解离相600秒，使用10mM甘氨酸-HCl pH 1.5进行再生。通过参比流动池（固定BSA）和空白进样进行双参比校正后，使用1:1 Langmuir结合模型进行全局拟合。结果显示，不同抗体克隆的KD值差异显著，范围从0.03nM到12nM，其中亲和力**强的克隆A的KD为0.03nM（ka=2.1×10⁵ M⁻¹s⁻¹，kd=6.3×10⁻⁶ s⁻¹，解离半衰期约30小时），而临床对照抗体Pembrolizumab的KD为0.12nM。动力学分析揭示，克隆A的高亲和力主要源于极慢的解离速率（kd低），而非快速结合。进一步通过SPR检测了抗体与PD-1的竞争结合表位，将抗体分为3个不同的表位组。功能实验表明，KD≤0.5nM且kd≤1×10⁻⁴ s⁻¹的抗体在细胞水平PD-1/PD-L1阻断实验中表现出更强的IL-2分泌恢复能力，揭示了慢解离动力学与药效的相关性。基于SPR动力学数据，研究者对克隆A进行了亲和力成熟，获得了KD为0.008nM的优化抗体，在小鼠肿瘤模型中显示出更优的抗肿瘤效果。该研究展示了SPR在抗体药物发现和优化中的核心价值，精确的动力学参数为抗体筛选和工程化改造提供了关键定量依据。该SPR结果与ELISA、FACS和细胞功能实验结果高度一致。
研究利用表面等离子共振（SPR）技术高通量筛选了靶向KRAS G12C突变体的小分子抑制剂，并通过精确的动力学表征揭示了化合物的结合机制和构效关系。KRAS G12C是多种实体瘤（如非小细胞肺癌）中的常见致癌突变，其Switch II口袋（Switch II pocket）是近年来发现的可成药位点。研究者将重组KRAS G12C蛋白（GDP结合态）通过Ni-NTA捕获固定在NTA芯片表面（固定水平约3000RU），首先对包含5000个化合物的聚焦库进行单浓度（20μM）SPR初筛，以结合响应≥50RU且DMSO校正后信号稳定为阳性标准，初筛获得87个阳性化合物。对阳性化合物进行7个浓度梯度（0.01μM至50μM，3倍稀释）的SPR动力学检测，使用稳态亲和力模型和1:1结合模型拟合，获得KD值范围从0.02μM到15μM。其中排名前三的化合物（化合物A、B、C）的KD分别为0.02μM、0.08μM和0.15μM，且均表现出慢结合慢解离的动力学特征（ka约10³-10⁴ M⁻¹s⁻¹，kd约10⁻⁴-10⁻³ s⁻¹），提示其与KRAS G12C的结合涉及构象变化。进一步通过SPR竞争实验验证了这些化合物均结合于Switch II口袋（与已知Sotorasib竞争结合），且化合物A与GDP的结合不冲突。分子动力学模拟和共晶结构证实了SPR动力学数据的准确性，化合物A通过共价键与Cys12结合并诱导Switch II区域构象变化，解释了其慢结合动力学。细胞实验显示，KD≤0.1μM的化合物在KRAS G12C突变的NCI-H358细胞中有效抑制ERK磷酸化（IC50与SPR KD呈正相关），并诱导细胞凋亡。该研究**终将化合物A推进为先导化合物，经过结构优化获得了临床候选药物。该研究展示了SPR在小分子药物筛选中的高通量能力和精确的动力学表征能力，为靶向"不可成药"靶点的药物发现提供了重要技术支撑。该SPR结果与ITC、荧光偏振和细胞实验结果一致。
Q&A 常见问题
SPR与ITC、MST、BLI有什么区别？应该如何选择？
这四种技术都是无标记检测生物分子相互作用的常用方法，但原理和适用场景各有不同：①SPR（表面等离子共振）：配体固定在芯片表面，分析物流过，实时检测折射率变化，获得ka、kd、KD，灵敏度高，适合蛋白-蛋白、抗体-抗原、蛋白-小分子，是动力学检测金标准，但需要固定配体且可能存在固定导致的活性损失；②ITC（等温滴定量热法）：在溶液中直接测量结合产生的热量变化，获得KD、化学计量比（n）、焓变（ΔH）和熵变（ΔS），完全在溶液中进行无需固定，能提供热力学信息，但样品用量大（通常数百微克）、耗时长、不适合弱亲和力（KD>μM级）和高通量；③MST（微量热泳动）：基于分子在温度梯度下的泳动速度变化检测结合，在溶液中进行，样品用量极少（nL级），适合膜蛋白和难纯化蛋白，但只能获得KD不能获得ka/kd，且对缓冲液成分敏感；④BLI（生物膜干涉技术，如Octet）：与SPR原理类似但使用光纤生物传感器，检测干涉光谱位移，可同时检测8-96个样品，通量更高，操作更简单，但动力学精度和灵敏度略低于SPR。选择原则：需要精确ka/kd动力学参数→SPR；需要热力学参数（ΔH/ΔS）和化学计量比→ITC；样品极少或膜蛋白→MST；需要高通量筛选（96通道）→BLI。论文发表通常建议SPR作为主要动力学方法，配合ITC或MST互为验证。
SPR可以检测哪些类型的分子互作？对分子量有限制吗？
SPR可以检测几乎所有类型的生物分子相互作用，包括：①蛋白质-蛋白质相互作用（如受体-配体、酶-底物、信号通路蛋白复合物）；②抗体-抗原相互作用（抗体亲和力表征、表位分组、交叉反应检测）；③蛋白质-小分子相互作用（药物靶点结合、化合物筛选、片段化合物筛选）；④蛋白质-核酸相互作用（蛋白-DNA、蛋白-RNA、转录因子-启动子）；⑤蛋白质-脂质/膜相互作用；⑥核酸-核酸相互作用（DNA-DNA、DNA-RNA杂交）；⑦细胞-蛋白相互作用（全细胞传感）。关于分子量限制：SPR的检测原理是质量变化引起的折射率变化，因此理论上对分子量没有严格下限，但实际检测中，分析物分子量越小，产生的RU信号越弱，信噪比越低。对于大分子分析物（蛋白、抗体，通常>10kDa），信号强，容易检测；对于小分子分析物（<1kDa），需要提高配体固定水平（通常>5000RU）、使用高灵敏度仪器（如Biacore 8K/8K+）、或采用捕获法（如将小分子固定在芯片上，蛋白作为分析物流过，即"反向SPR"）来提高信号。目前SPR已能可靠检测分子量低至100Da的小分子化合物，是药物筛选中**常用的无标记技术。对于极弱的相互作用（KD>100μM），由于结合响应低且解离快，SPR检测难度较大，可考虑使用核磁共振（NMR）或X射线晶体学补充。
SPR实验如何选择固定化方法和传感芯片？固定会影响蛋白活性吗？
SPR固定化方法和芯片的选择取决于配体分子的性质和实验目的，常用方案包括：①CM5芯片+氨基偶联（Amine Coupling）：**通用的方法，通过EDC/NHS活化芯片表面的羧甲基葡聚糖，与配体的伯胺（赖氨酸侧链或N端氨基）共价结合，适合大多数蛋白和抗体，优点是固定牢固、芯片可重复使用，缺点是随机取向固定可能遮挡结合位点；②SA芯片+生物素化配体：链霉亲和素包被的芯片，捕获生物素标记的配体，固定均一、取向可控、活性保留好，适合核酸（生物素标记的DNA/RNA）和可生物素化的蛋白，但需要先对配体进行生物素标记；③NTA芯片+His标签蛋白：Ni-NTA表面捕获带His标签的重组蛋白，固定条件温和、可逆、取向均一，适合重组蛋白，但固定稳定性不如共价偶联，再生条件需温和；④Protein A/G芯片+抗体：捕获抗体的Fc段，使抗体Fab段均朝外，适合抗体作为配体的实验；⑤CM4/CM3芯片：低容量葡聚糖基质，适合大分子分析物或需要低固定水平的实验（减少质量传递限制）。固定化对蛋白活性的影响是SPR实验的关键考量：氨基偶联是随机共价固定，可能导致部分蛋白的结合位点被遮挡或构象改变，因此需优化固定pH（通常比蛋白pI低0.5-1个单位）和固定水平（避免过高导致空间位阻）。推荐优先使用位点特异性固定（如SA芯片捕获生物素化配体、NTA捕获His标签蛋白），以**大程度保留蛋白活性。固定后需通过阳性对照（已知能结合的分析物）验证配体活性，如果活性低可尝试更换固定方法或降低固定水平。
SPR结果中的ka、kd、KD分别代表什么？如何判断数据质量？
SPR动力学分析提供三个核心参数：①ka（结合速率常数，也写作kon）：单位M⁻¹s⁻¹，表示分析物与配体结合的快慢，ka越大结合越快，典型蛋白-蛋白互作的ka范围为10³-10⁷ M⁻¹s⁻¹；②kd（解离速率常数，也写作koff）：单位s⁻¹，表示复合物解离的快慢，kd越小解离越慢、复合物越稳定，典型范围为10⁻⁶-10⁻¹ s⁻¹，可换算为解离半衰期t₁/₂ = ln2/kd；③KD（平衡解离常数）：单位M，KD = kd/ka，表示亲和力强弱，KD越小亲和力越强，典型范围为pM（极强）到mM（极弱），nM级为高亲和力，μM级为中等亲和力。判断SPR数据质量的关键指标：①传感图质量：基线平稳（漂移<0.1RU/min），结合相响应随浓度递增，解离相呈指数下降，无明显尖峰或跳变；②双参比校正：校正后的传感图在t=0时回归基线，无系统性偏移；③拟合优度：使用1:1 Langmuir模型全局拟合时，Chi²值应小于**大响应的5%（通常<10RU²），残差（Residuals）应随机分布在零线附近，无系统性偏离（如U形或波浪形残差提示模型不适用，可能存在二价结合、构象变化或质量传递限制）；④浓度梯度完整性：至少5个浓度点，覆盖KD值的0.1倍到10倍范围，**高浓度应接近饱和结合；⑤可重复性：同一浓度重复进样的响应差异应<5%，再生后基线恢复良好。如果数据质量不达标，需优化实验条件（如降低固定水平减少质量传递限制、延长解离相、更换结合模型、提高样品纯度）后重新检测。
SPR实验对样品有什么要求？需要多少量？样品不纯会影响结果吗？
SPR对样品质量要求较高，样品纯度和稳定性直接影响数据可靠性：①配体样品（固定在芯片上）：蛋白建议纯度≥90%（SDS-PAGE或SEC验证），浓度≥0.5mg/mL，总量≥50μg（实际固定消耗约5-20μg，其余用于条件优化）；样品应不含高浓度甘油（>5%）、EDTA（>5mM，会干扰NTA芯片）、还原剂（DTT/β-巯基乙醇，会破坏二硫键和金膜）、去垢剂（>0.01%，除非实验必需）；如含这些成分需在固定前换液至合适的固定缓冲液（如10mM醋酸钠pH4.5-5.5）。②分析物样品（流过芯片）：蛋白/抗体建议纯度≥90%，浓度≥1mg/mL，总量≥100μg（实际消耗约20-50μg）；小分子建议纯度≥95%，以DMSO配制储备液（通常10mM），**终DMSO浓度≤5%（需做DMSO校正）；总量根据浓度梯度和进样体积计算，通常每个浓度需50-100μL。③样品不纯的影响：配体不纯会导致杂蛋白同时被固定在芯片上，分析物可能与杂蛋白结合，产生假阳性或干扰动力学拟合；分析物不纯（如含聚集体、降解片段）会导致传感图异常（如快结合快解离的聚集体信号、基线漂移），拟合得到的ka/kd/KD不准确。因此建议在SPR实验前对样品进行SEC纯化或超滤去除聚集体，通过SDS-PAGE和A280/A260比值评估纯度。对于易聚集的蛋白，可在运行缓冲液中添加0.005%-0.02% P20或Tween-20去垢剂，并在进样前离心（10000g, 10min, 4°C）去除沉淀。南京高斯生物在SPR实验前会对样品进行质量评估，如样品不达标会建议纯化或重新制备。
