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RNA pulldownRNA pull-down（RNA沉降实验）是检测RNA结合蛋白（RNA-binding protein，RBP）与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一，也是近年来研究lncRNA、circRNA、miRNA与蛋白质相互作用的核心技术。该技术基于生物素-链霉亲和素（Biotin-Streptavidin）高亲和力结合体系，在体外接近生理条件的缓冲液环境中，让细胞裂解液内成千上万的蛋白质与固定的RNA探针接触，能够与该RNA特异性结合的蛋白质（无论是直接结合还是通过蛋白复合物间接结合）会被"捕获"在磁珠上，经严格洗涤去除非特异性结合蛋白后，回收结合蛋白进行下游检测。根据下游检测方式的不同，RNA pull-down主要分为两种应用模式：①RNA pull-down + Western Blot（WB）验证：适用于已有候选RNA结合蛋白的验证研究，用候选蛋白的特异性抗体检测pull-down产物中是否富集该蛋白，通过比较正义RNA组与反义RNA对照组的信号差异判断结合特异性，是验证特定RNA-蛋白相互作用的经典方法；②RNA pull-down + 质谱（LC-MS/MS）鉴定：适用于筛选与目标RNA结合的未知蛋白，将pull-down产物进行SDS-PAGE分离、胶内酶解后进行液相色谱-串联质谱分析，通过数据库搜索鉴定蛋白，并比较实验组与对照组的差异蛋白，筛选候选RBP，配合Label-free或TMT定量质谱可获得更可靠的定量结果。 RNA pull-down技术的核心优势在于能够在体外接近生理条件下直接检测RNA与蛋白质的物理结合，既可验证已知候选蛋白，也可联合质谱筛选未知RNA结合蛋白。与酵母三杂交（Y3H）等体内筛选技术相比，RNA pull-down操作简便、周期短、不需要构建质粒和酵母转化，可直接使用细胞或组织样品，且能同时捕获直接结合和间接结合（通过蛋白复合物）的蛋白。RNA pull-down实验必须进行严格的对照设置以排除假阳性：反义RNA对照（Antisense RNA）是**关键的阴性对照，使用目标RNA的反义序列作为探针，反义RNA与正义RNA具有相同的核苷酸组成但二级结构和序列方向不同，能有效排除基于序列组成非特异性结合的蛋白；空磁珠对照（Beads only）不加RNA探针，排除蛋白与链霉亲和素磁珠本身的非特异性吸附；Input对照为总蛋白裂解液，用于验证蛋白提取质量和作为WB的阳性对照；阳性对照可使用已知的RNA-蛋白结合对（如铁蛋白IRE-IRP1、组蛋白茎环-SLBP）验证实验体系的可靠性。对于质谱筛选，建议采用定量质谱策略（Label-free或TMT标记），通过实验组与对照组的蛋白丰度比值（通常要求FC≥2且p<0.05）筛选特异性结合蛋白，有效降低假阳性。RNA pull-down筛选得到的候选RNA结合蛋白通常需要进一步通过RIP-qPCR/RIP-seq、EMSA、CLIP-seq、荧光素酶报告实验等技术进行独立验证，以确认相互作用的真实性和生物学意义。 图：RNA pull-down实验原理与操作流程 服务优势🧲 体外直接验证互作在接近生理条件的缓冲液中直接检测RNA与蛋白的物理结合，可区分直接结合与间接结合，结果直观可靠，操作简便周期短。 🔬 可联合质谱筛选未知蛋白支持WB验证已知候选蛋白和LC-MS/MS质谱筛选未知RNA结合蛋白两种模式，配合Label-free/TMT定量质谱，一次性获得多个候选RBP。 ✅ 对照体系严谨完整设置反义RNA对照、空磁珠对照、Input对照和阳性对照，配合定量质谱差异分析，严格排除非特异性结合，有效降低假阳性率。 📊 交付内容完整提供生物素RNA探针制备结果、RNA完整性检测图、pull-down实验原始图片、WB验证结果、质谱鉴定报告、差异蛋白分析及详细实验报告，可直接用于论文发表。 服务流程1 接收订单及序列 确认实验方案 接收RNA序列/细胞样品 2 生物素RNA探针制备 T7模板构建+体外转录标记 RNA完整性与纯度检测 3 RNA探针固定化 生物素RNA与链霉亲和素磁珠结合 封闭非特异性位点 4 蛋白裂解液孵育 制备细胞/组织总蛋白裂解液 与RNA-磁珠复合物4°C孵育 5 洗涤与洗脱 高盐缓冲液多次洗涤 加热变性洗脱复合物 6 检测与分析交付 WB验证或LC-MS/MS质谱鉴定 差异蛋白分析报告交付 客户提供样品与材料要求
服务说明
案例展示RNA pull-down联合质谱筛选鉴定与lncRNA NEAT1结合的RNA结合蛋白及其在肿瘤发生中的功能机制 研究利用RNA pull-down联合定量质谱技术筛选并鉴定了与长链非编码RNA NEAT1（核富集丰富转录本1）结合的RNA结合蛋白。NEAT1是paraspeckle亚核结构的核心骨架RNA，在多种肿瘤中高表达并与不良预后相关。研究者设计了覆盖NEAT1全长（约3.7kb）的4个重叠RNA片段（每个约1kb），分别通过T7体外转录合成生物素标记的正义RNA探针和反义RNA对照探针。以Hela细胞总蛋白裂解液为原料，进行大规模RNA pull-down实验，每组使用5mg总蛋白，设置3组生物学重复。pull-down产物经SDS-PAGE分离后进行TMT标记定量质谱分析。通过比较正义RNA组与反义RNA对照组的蛋白丰度，以FC≥2且p<0.05为阈值，共筛选到47个与NEAT1特异性结合的候选蛋白，其中包括已知的NEAT1结合蛋白NONO、PSPC1、FUS（阳性对照验证），以及12个尚未报道的新型NEAT1结合蛋白。GO富集分析显示这些蛋白显著富集于"RNA剪接"、"mRNA加工"和"基因表达调控"等生物学过程。进一步通过RNA pull-down-WB验证了排名前三的新型结合蛋白（DDX3X、HNRNPK、SRSF1）与NEAT1的直接结合，RIP-qPCR验证了这些蛋白在细胞内与NEAT1的相互作用。功能实验表明，HNRNPK通过与NEAT1的5'端区域结合，促进NEAT1介导的paraspeckle形成和靶基因转录抑制，HNRNPK敲低显著抑制肿瘤细胞增殖和迁移。该研究展示了RNA pull-down联合定量质谱在lncRNA结合蛋白筛选中的强大能力，为NEAT1的功能机制研究提供了新的调控因子。 RNA pull-down-WB验证circRNA CDR1as与RNA结合蛋白IGF2BP3的直接结合及其在肝癌中的ceRNA调控机制 研究利用RNA pull-down-Western Blot技术验证了环状RNA CDR1as（也称为ciRS-7）与RNA结合蛋白IGF2BP3（胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白3）的直接相互作用，并阐明了其在肝细胞癌（HCC）中的ceRNA调控机制。CDR1as是一种高度保守的环状RNA，含有超过70个miR-7结合位点，在肝癌中异常表达。研究者通过T7体外转录合成了生物素标记的CDR1as正义RNA探针和反义RNA对照探针，以HepG2肝癌细胞总蛋白裂解液进行RNA pull-down实验。Western Blot结果显示，IGF2BP3在CDR1as正义RNA pull-down产物中显著富集，而在反义RNA对照和空磁珠对照中几乎检测不到信号，Input对照显示IGF2BP3在总蛋白中正常表达，灰度分析显示正义组富集倍数达反义组的8.6倍，证明IGF2BP3与CDR1as存在特异性结合。进一步的RNA pull-down竞争实验显示，加入过量的未标记CDR1as RNA可剂量依赖性地竞争掉IGF2BP3的结合信号，而加入无关RNA则无竞争效果，进一步证实了结合的特异性。RIP-qPCR实验使用IGF2BP3抗体进行RNA免疫沉淀，结果显示CDR1as在IGF2BP3免疫沉淀物中富集约12倍，与RNA pull-down结果一致。功能机制研究表明，IGF2BP3通过结合CDR1as，保护CDR1as免受核酸外切酶降解，增强其稳定性，从而增强CDR1as作为miR-7海绵的ceRNA功能，上调miR-7靶基因（如EGFR、RAF1）的表达，促进肝癌细胞增殖和侵袭。该研究展示了RNA pull-down-WB在验证特定RNA-蛋白相互作用中的可靠性和直观性，是circRNA-蛋白互作研究的经典验证方案。 Q&A 常见问题RNA pull-down和RIP有什么区别？应该如何选择？ RNA pull-down和RIP（RNA Immunoprecipitation，RNA免疫沉淀）是研究RNA-蛋白相互作用的两种互补技术，核心区别在于"垂钓方向"不同：①RNA pull-down以RNA为诱饵（Bait），用生物素标记的RNA探针从蛋白裂解液中"钓取"结合蛋白，属于"以RNA钓蛋白"，适合筛选与特定RNA结合的未知蛋白（联合质谱）或验证特定RNA与候选蛋白的结合；②RIP以蛋白为诱饵，用目标蛋白的抗体从细胞裂解液中免疫沉淀蛋白及其结合的RNA，属于"以蛋白钓RNA"，适合验证特定蛋白是否结合目标RNA，以及筛选该蛋白结合的所有RNA（联合测序即RIP-seq）。选择原则：研究目标是"这个RNA结合了哪些蛋白"→选RNA pull-down（联合质谱）；研究目标是"这个蛋白结合了哪些RNA"→选RIP（联合测序）；验证特定RNA-蛋白对→两种方法均可，建议同时使用互为验证（RNA pull-down-WB + RIP-qPCR是论文发表的经典组合）；RNA pull-down是体外实验，RIP是体内（细胞内）实验，两者结合可提供更全面的证据。 RNA pull-down实验中如何有效排除假阳性？ RNA pull-down的假阳性主要来自蛋白与磁珠的非特异性吸附、蛋白与RNA的序列组成非特异性结合、以及RNA探针降解导致的背景升高。排除假阳性的关键策略包括：①反义RNA对照（**关键）：反义RNA与正义RNA核苷酸组成相同但序列方向和二级结构不同，能有效排除基于核苷酸组成的非特异性结合蛋白，只有在正义组富集而反义组不富集的蛋白才是特异性结合蛋白；②空磁珠对照：不加RNA探针，排除蛋白与链霉亲和素磁珠本身的非特异性吸附；③严格洗涤：使用含300-500mM NaCl的高盐洗涤缓冲液多次洗涤（通常3-5次），去除弱非特异性结合；④封闭处理：孵育前用酵母tRNA、BSA或肝素封闭磁珠，减少蛋白的非特异性吸附；⑤定量质谱差异分析：对于质谱筛选，采用TMT或Label-free定量，以FC≥2且p<0.05为阈值筛选差异蛋白，统计显著性过滤假阳性；⑥竞争实验验证：加入过量未标记的同源RNA进行竞争，若信号被剂量依赖性竞争掉则为特异性结合；⑦独立技术验证：筛选到的候选蛋白需通过RIP-qPCR、EMSA、CLIP-seq等独立技术验证。 目标RNA的长度对RNA pull-down实验有什么影响？长链lncRNA如何处理？ 目标RNA长度直接影响探针制备效率、RNA二级结构形成和蛋白结合能力：①短RNA（50-500nt）：体外转录效率高，RNA完整性好，二级结构相对简单，是RNA pull-down的理想长度范围；②中等长度RNA（500-1500nt）：体外转录可获得完整产物，但需注意RNA降解问题，建议转录后立即进行完整性检测；③长RNA（>1500nt）：体外转录可能出现截短产物，长RNA易降解，且复杂的二级结构可能影响蛋白结合位点的可及性。对于全长lncRNA（通常>2kb），建议采用分段策略：将长RNA截短为多个重叠的片段（每个500-1000nt，重叠约100-200nt），分别进行RNA pull-down，以精确定位蛋白结合区域。这种分段策略不仅能提高实验成功率，还能将结合蛋白定位到具体的RNA结构域，为后续机制研究提供更精确的信息。此外，对于已知结合区域的RNA，可直接克隆该区域进行pull-down，提高特异性和灵敏度。 RNA pull-down得到的阳性结果如何进行后续验证？ RNA pull-down筛选或验证得到的RNA-蛋白相互作用需要通过多种独立技术交叉验证，以确保结果的可靠性和生物学意义：①RIP-qPCR/RIP-seq：用候选蛋白的抗体进行RNA免疫沉淀，qPCR检测目标RNA的富集程度，这是**常用的体内验证方法，与RNA pull-down（体外）互为补充；②EMSA（RNA-蛋白凝胶迁移实验）：体外纯化候选蛋白，与标记的RNA探针孵育后进行非变性PAGE电泳，观察RNA-蛋白复合物的迁移率变化，可验证直接结合并测定结合亲和力（Kd）；③CLIP-seq（交联免疫沉淀测序）：通过UV交联在细胞内固定RNA-蛋白相互作用，免疫沉淀后测序鉴定结合位点，能提供体内直接结合和精确结合位点信息，是金标准级验证；④RNA pull-down竞争实验：加入过量未标记的同源RNA或突变体RNA，验证结合的特异性和关键结合区域；⑤荧光素酶报告实验：将目标RNA序列克隆到报告基因体系，验证RNA结合蛋白对目标RNA功能（如mRNA稳定性、翻译效率）的调控作用；⑥功能实验：基因过表达或敲低后检测目标RNA的表达、定位、翻译变化和细胞表型变化，阐明相互作用的生物学功能。论文发表通常要求至少2-3种独立技术验证。 RNA pull-down实验需要多少细胞或组织样品？样品如何保存和运输？ 样品量取决于检测方式：①WB验证模式：每个pull-down反应建议使用500μg-1mg总蛋白，对应约5×10⁶-1×10⁷个细胞或20-30mg组织，加上Input和对照，建议提供2-3×10⁷个细胞或50-100mg组织/样本；②质谱筛选模式：由于质谱灵敏度要求，每个pull-down反应建议使用3-5mg总蛋白，对应约3-5×10⁷个细胞或100-200mg组织，加上对照组和生物学重复，总样品量需相应增加。样品保存与运输：细胞样品收集后用PBS洗涤一次，去除上清后将细胞沉淀直接置于液氮速冻，然后转移至-80°C保存，运输时使用干冰（确保干冰充足，运输时间不超过48小时）；组织样品取材后立即用液氮速冻，-80°C保存，干冰运输。也可由客户在实验室制备蛋白裂解液（在含RNase抑制剂和蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中裂解，测定蛋白浓度后分装速冻），干冰运输。注意：样品切忌反复冻融，反复冻融会导致RNA和蛋白降解，严重影响实验结果。建议收到样品后立即进行实验或一次性分装保存。 需要 RNA pull-down 实验技术服务？南京高斯生物为您提供从生物素RNA探针制备到WB验证/质谱鉴定的一站式专业服务 📞 全国统一服务热线：13675123245 📧 邮箱：1632273990@qq.com 📍 地址：南京市江宁区天元东路2289号5C栋405 在线询价 技术咨询上一篇酵母三杂交下一篇荧光素酶蛋白互补实验(LCA) |
