服务介绍
DNA pull-down（DNA沉淀实验，DNA Pull-Down Assay）是一种广泛应用的体外蛋白质与DNA相互作用研究技术，常用于转录因子结合验证、启动子/增强子结合蛋白筛选、DNA结合蛋白鉴定等研究领域。其基本原理是：首先合成目标DNA序列（通常是基因启动子、增强子或其他调控区域的双链DNA片段，长度约50-500bp），并在DNA的5'端或3'端进行生物素（Biotin）标记。将生物素标记的DNA探针与核蛋白提取物（含有转录因子、染色质重塑因子、DNA结合蛋白等）在适宜的结合缓冲液中共同孵育，核蛋白中能够特异性识别该DNA序列的蛋白（如转录因子）会与DNA探针结合，形成DNA-蛋白复合物。然后加入链霉亲和素（Streptavidin）包被的磁珠，链霉亲和素与生物素之间具有极高的亲和力（解离常数Kd约10⁻¹⁵ M），能够高效、特异性地捕获生物素标记的DNA探针及其结合的蛋白复合物。经过充分洗涤去除未结合的杂蛋白和非特异性结合蛋白后，用SDS上样缓冲液煮沸洗脱或用高盐/竞争性洗脱液洗脱结合蛋白。**后，根据实验目的选择检测方法：如果已有候选结合蛋白（如特定转录因子），用Western Blot进行特异性检测；如果需要筛选未知的结合蛋白，用SDS-PAGE分离后进行LC-MS/MS质谱鉴定，获得完整的DNA结合蛋白组信息。
DNA pull-down 技术的核心优势在于能够在体外条件下高效富集和筛选与特定DNA序列结合的蛋白质，尤其适合发现新的DNA结合蛋白和转录因子。与 EMSA 相比，DNA pull-down 可以捕获更多量的结合蛋白，适合后续质谱鉴定；与 ChIP-qPCR 相比，DNA pull-down 是体外实验，操作更简单，不需要ChIP级别的抗体，且可以自由设计DNA探针序列（包括突变体、截短体），适合定位蛋白结合的具体DNA序列元件。实验通常设置以下对照：野生型DNA探针（实验组）、突变型DNA探针（结合位点定点突变，阴性对照，验证结合特异性）、未标记DNA探针（排除链霉亲和素磁珠的非特异性结合）、冷探针竞争（加入过量未标记野生型探针，竞争结合，进一步验证特异性）。DNA pull-down 与 EMSA、ChIP-qPCR 等技术结合使用，可以从体外到体内全面验证蛋白-DNA相互作用。
图：DNA pull-down 实验原理与操作流程
服务优势
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探针设计灵活
可根据研究需求设计野生型、结合位点突变型、截短体等多种DNA探针，精确定位蛋白结合的DNA序列元件。
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双检测平台
提供Western Blot检测已知候选蛋白和LC-MS/MS质谱鉴定未知结合蛋白两种检测平台，满足验证和筛选不同需求。
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对照体系完整
每例实验设置野生型探针、突变型探针、未标记探针、冷探针竞争等多重对照，有效排除非特异性结合，确保结果可靠。
📊
交付内容完整
提供原始WB图片、银染/考染凝胶图片、质谱鉴定蛋白列表、生物信息学分析及详细实验报告，可直接用于论文发表。
服务流程
1
接收订单及序列
确认实验方案
接收DNA序列/样品
接收DNA序列/样品
2
探针合成与标记
合成目标DNA探针
5'端生物素标记
5'端生物素标记
3
核蛋白提取
提取细胞核蛋白
BCA定量
BCA定量
4
孵育与磁珠捕获
DNA探针与核蛋白孵育
链霉亲和素磁珠捕获
链霉亲和素磁珠捕获
5
洗涤与洗脱
洗涤去除非特异结合
SDS煮沸洗脱蛋白
SDS煮沸洗脱蛋白
6
检测与交付
WB检测或质谱鉴定
数据分析报告交付
数据分析报告交付
客户提供
样品与材料要求
DNA探针序列：需提供目标DNA序列信息（如基因启动子、增强子区域序列），或委托我司根据基因ID和转录起始位点位置设计合成。
▶ 探针长度建议50-500bp，过短可能丢失结合位点，过长可能增加非特异性结合；▶ 如需突变型探针，需提供突变位点信息（如预测转录因子结合位点的定点突变）；▶ 也可提供已合成的DNA探针（需5'端生物素标记，HPLC纯化）。细胞/组织样品：用于核蛋白提取。
▶ 细胞：≥ 5×10⁶ 个细胞/pull-down反应，建议提供1-2×10⁷ 个细胞/组；▶ 组织：动物组织 ≥ 0.5g/反应，新鲜或 -80℃ 冻存，干冰运输；▶ 也可提供已提取的核蛋白：≥ 500μg/反应，浓度 ≥ 1μg/μL，干冰运输。抗体（WB检测）：如需 Western Blot 检测已知候选结合蛋白，需提供目标蛋白抗体，抗体量 ≥ 10μL/次，需提供抗体说明书或品牌货号。也可委托我司代购。
实验信息：需提供目标基因名称、ID、DNA探针序列位置信息、候选结合蛋白名称（如已知）、细胞类型、处理条件、检测方式（WB/质谱）、是否需要突变型对照和冷探针竞争实验。
服务说明
| 服务名称 | 服务内容 | 交付内容及标准 | 服务周期(工作日) |
|---|---|---|---|
| DNA pull-down-WB | 探针合成与标记 | 合成目标DNA双链探针，5'端生物素标记，HPLC纯化，含野生型和突变型对照 | 15 |
| 核蛋白提取 | 提取细胞核蛋白，BCA定量，SDS-PAGE验证蛋白完整性 | ||
| pull-down实验 | 生物素探针与核蛋白孵育，链霉亲和素磁珠捕获，设野生型、突变型、未标记对照，严格洗涤 | ||
| 洗脱与电泳 | SDS煮沸洗脱，SDS-PAGE电泳分离 | ||
| WB检测 | Western Blot检测1-3个候选结合蛋白，提供原始图片、灰度定量分析及实验报告 | ||
| DNA pull-down-MS | 探针合成与标记 | 合成目标DNA双链探针，5'端生物素标记，HPLC纯化 | 25 |
| 核蛋白提取 | 提取细胞核蛋白，BCA定量 | ||
| pull-down实验 | 生物素探针与核蛋白孵育，链霉亲和素磁珠捕获，设野生型和突变型对照，严格洗涤 | ||
| 洗脱与电泳 | SDS煮沸洗脱，SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝或银染显色 | ||
| 质谱鉴定与分析 | 差异条带切胶酶解，LC-MS/MS质谱鉴定，提供结合蛋白列表、GO功能注释、KEGG通路富集分析及详细实验报告 | ||
| DNA pull-down 竞争验证 | 探针合成 | 合成生物素标记野生型探针、未标记野生型冷探针、突变型探针 | 18 |
| 核蛋白提取 | 提取细胞核蛋白，BCA定量 | ||
| 竞争pull-down | 设置生物素探针组、50倍冷探针竞争组、100倍冷探针竞争组、突变型探针对照组 | ||
| 洗脱与WB | SDS洗脱，SDS-PAGE电泳，Western Blot检测候选蛋白 | ||
| 数据分析 | 提供各组WB图片、灰度定量、竞争抑制率计算及详细实验报告 |
案例展示
DNA pull-down 结合质谱鉴定 MMP-9 启动子区新型转录因子结合蛋白
研究利用 DNA pull-down 结合 LC-MS/MS 质谱技术，筛选并鉴定了与基质金属蛋白酶-9（MMP-9）基因启动子区结合的新型转录因子。合成 MMP-9 启动子转录起始位点上游 -1000bp 至 +100bp 区域的生物素标记双链DNA探针，与乳腺癌细胞系 MDA-MB-231 的核蛋白提取物孵育，链霉亲和素磁珠捕获DNA-蛋白复合物。SDS-PAGE分离后银染显色，与突变型探针对照组比较，发现野生型探针组有3条明显差异条带。切胶酶解后进行LC-MS/MS质谱鉴定，共鉴定出28个特异性结合蛋白，包括已知的NF-κB p65、AP-1（c-Jun/c-Fos）等转录因子，以及尚未报道的核蛋白NONO、PSPC1等。GO富集分析显示结合蛋白主要参与转录调控、RNA剪接、染色质重塑等生物学过程。进一步用DNA pull-down-WB和ChIP-qPCR验证了NONO与MMP-9启动子的直接结合，功能实验显示NONO敲低可显著抑制MMP-9的表达和乳腺癌细胞的侵袭能力。该研究为MMP-9转录调控机制提供了新的候选靶点。
DNA pull-down 验证 Nrf2 与 HO-1 启动子 ARE 元件的特异性结合
利用 DNA pull-down-WB 技术验证了转录因子 Nrf2 与血红素加氧酶-1（HO-1）基因启动子区抗氧化响应元件（ARE）的特异性结合。合成 HO-1 启动子区含 ARE 元件（5'-GTGACNNNGC-3'）的 60bp 生物素标记双链DNA探针（野生型），同时合成 ARE 核心位点定点突变的突变型探针作为阴性对照。将探针与 HepG2 细胞核蛋白提取物（经 tBHQ 处理激活 Nrf2 核转位）孵育，链霉亲和素磁珠捕获后洗涤洗脱。Western Blot 用 Nrf2 抗体检测，结果显示野生型探针组可检测到明显的 Nrf2 条带，而突变型探针组和未标记探针组均无明显条带，证明 Nrf2 与 HO-1 启动子 ARE 元件的结合具有序列特异性。进一步的冷探针竞争实验显示，加入50倍和100倍过量未标记野生型探针后，Nrf2 条带分别减弱了62%和89%，呈剂量依赖性竞争抑制，进一步验证了结合的特异性。该研究与 EMSA、ChIP-qPCR 结果一致，为 Nrf2-ARE 通路的转录调控机制提供了体外验证证据。
Q&A 常见问题
DNA pull-down 与 EMSA、ChIP-qPCR 有什么区别？该如何选择？
三者都是研究蛋白-DNA互作的技术，但原理和应用场景不同：①EMSA（凝胶迁移实验）是体外实验，将核蛋白与标记的核酸探针在体外孵育，通过非变性电泳观察迁移率变化，适合验证已知序列的结合，灵敏度高，但只能检测蛋白-探针复合物的存在，无法鉴定具体是哪个蛋白，且探针通常较短（20-50bp）；②DNA pull-down 也是体外实验，用生物素标记的DNA探针捕获结合蛋白，然后用WB或质谱检测，适合筛选和鉴定未知的DNA结合蛋白，探针可以更长（50-500bp），能捕获更多蛋白，但操作比EMSA复杂；③ChIP-qPCR 是体内实验，在活细胞内交联固定蛋白-DNA复合物，用抗体沉淀后qPCR检测DNA富集，反映体内真实染色质环境下的结合，但需要ChIP级别的抗体，操作更复杂。选择原则：初步验证已知蛋白与已知序列的结合用 EMSA（简单快速）；筛选未知结合蛋白或需要质谱鉴定用 DNA pull-down；验证体内真实结合或组蛋白修饰用 ChIP-qPCR。一般建议 DNA pull-down 与 EMSA、ChIP-qPCR 结合使用，体外体内双重验证结果更可靠。
DNA pull-down 探针如何设计？长度和标记方式有什么要求？
DNA pull-down 探针的设计是实验成功的关键。设计原则：①探针长度：通常选择50-500bp的双链DNA片段。如果研究特定转录因子结合位点，可用较短的探针（50-100bp），包含预测的结合基序及两侧侧翼序列；如果筛选启动子区的所有结合蛋白，可用较长的探针（200-500bp），覆盖启动子核心区域。探针过短可能丢失重要结合位点，过长可能增加非特异性结合和二级结构。②标记方式：通常在DNA的5'端进行生物素（Biotin）标记，通过化学合成在引物5'端引入生物素，PCR扩增后获得生物素标记的双链探针。也可以在3'端标记，但5'端标记更常用，对蛋白结合影响更小。标记后的探针需HPLC或PAGE纯化，去除未标记的探针。③双链制备：DNA pull-down需要双链DNA探针，通常用生物素标记的正向引物和未标记的反向引物进行PCR扩增，获得一条链5'端生物素标记的双链DNA；或合成两条互补的单链寡核苷酸（5'端生物素标记正义链），退火形成双链。④对照探针设计：必须设计突变型探针（将预测的核心结合位点定点突变，如将ARE元件的GTGAC突变为AAAAA），作为阴性对照验证结合特异性；如需要竞争实验，还需合成未标记的野生型探针（冷探针）。⑤探针浓度：pull-down反应中探针终浓度通常为1-5μg/mL，需根据探针长度和结合蛋白丰度优化。南京高斯生物可根据基因信息和研究目的提供探针设计和合成服务。
DNA pull-down 核蛋白提取有什么注意事项？如何提高结合蛋白的得率？
核蛋白提取的质量直接影响 DNA pull-down 实验的成功率和结合蛋白得率。注意事项：①细胞处理：如果研究信号通路激活（如药物处理诱导转录因子核转位），需在核蛋白提取前进行适当的刺激处理（如LPS、TNF-α、缺氧、氧化应激等），确保转录因子已入核。可通过WB检测核蛋白中目标转录因子的表达量验证核转位效果。②核蛋白提取方法：推荐使用商业核蛋白提取试剂盒（如Thermo Pierce NE-PER、Millipore Nuclear Extraction Kit等），或自制低渗裂解/高盐提取法。关键是先裂解细胞膜和细胞质，分离细胞核，然后用高盐缓冲液（含420mM NaCl）提取核蛋白，避免胞质蛋白污染。③蛋白酶和磷酸酶抑制剂：核蛋白提取缓冲液中必须加入蛋白酶抑制剂（PMSF、蛋白酶抑制剂cocktail）和磷酸酶抑制剂（Na₃VO₄、NaF、β-甘油磷酸酯），防止蛋白降解和去磷酸化（转录因子的DNA结合活性常依赖磷酸化状态）。④蛋白浓度：核蛋白浓度建议在1-5μg/μL，每次pull-down反应用500-1000μg核蛋白。蛋白浓度过低会导致结合蛋白信号弱，过高可能增加非特异性结合。⑤蛋白完整性：提取后取少量核蛋白进行SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色，验证蛋白完整性和浓度，避免降解。⑥避免反复冻融：核蛋白应分装后 -80℃ 保存，避免反复冻融导致蛋白变性失活。⑦结合缓冲液优化：pull-down孵育缓冲液通常含10-20mM Tris-HCl（pH7.5）、50-150mM NaCl、1mM EDTA、1mM DTT、0.1% NP-40、5%甘油、poly(dI-dC)（非特异性竞争DNA，减少蛋白与DNA的非特异性结合）、BSA（减少蛋白非特异性吸附）。盐浓度和去污剂浓度需根据蛋白特性优化，过高会破坏特异性结合，过低会增加背景。南京高斯生物针对不同细胞类型和蛋白已建立优化的核蛋白提取和pull-down孵育条件。
DNA pull-down 实验如何设置对照？怎样判断结合是否具有特异性？
DNA pull-down 实验必须设置严格的对照体系，以排除非特异性结合，确保结果可靠。常用对照包括：①野生型探针组（实验组）：生物素标记的野生型DNA探针，用于捕获特异性结合蛋白。②突变型探针对照组（阴性对照）：将预测的蛋白结合核心位点（如转录因子结合基序）进行定点突变的生物素标记探针。如果野生型探针组有结合蛋白条带，而突变型探针组无明显条带，则证明结合依赖于该DNA序列元件，具有序列特异性。这是**重要的阴性对照。③未标记探针对照组：不加生物素标记的野生型DNA探针，其他条件相同。如果未标记探针组也有蛋白条带，说明存在链霉亲和素磁珠或离心管的非特异性蛋白吸附，需优化洗涤条件。④冷探针竞争组：在孵育体系中同时加入生物素标记探针和过量（50-200倍）的未标记野生型探针（冷探针）。冷探针会竞争结合蛋白，导致生物素探针捕获的蛋白量减少，呈剂量依赖性减少，进一步验证结合的特异性。如果冷探针竞争不影响蛋白结合，说明可能是非特异性结合。⑤Input对照组：取部分核蛋白提取物直接上样，作为阳性对照，证明核蛋白中存在目标蛋白。⑥抗体对照（WB检测时）：用无关抗体（同型IgG）进行WB检测，排除抗体非特异性识别。判断结合特异性的标准：①野生型探针组有明显的目标蛋白条带（WB）或差异蛋白条带（质谱）；②突变型探针组无明显条带或条带显著减弱；③未标记探针组无明显条带；④冷探针竞争组条带呈剂量依赖性减弱。满足以上条件即可认为蛋白与DNA的结合具有特异性。如果突变型探针仍有结合，可能结合位点不在突变区域，或存在多个结合位点，需进一步设计截短体或多点突变探针定位结合区域。
DNA pull-down 实验阴性结果（未检测到结合蛋白）可能是什么原因？
DNA pull-down 实验阴性结果（野生型探针组未检测到预期结合蛋白）可能原因包括：①目标蛋白在该细胞/条件下不表达或未入核：转录因子的DNA结合依赖于其核转位，如果细胞未经过适当刺激处理（如药物、缺氧、炎症因子），转录因子可能停留在胞质中，核蛋白提取物中目标蛋白含量低，导致pull-down信号弱。建议先通过WB检测核蛋白中目标蛋白的表达量，必要时优化刺激条件。②探针设计不当：探针未包含蛋白结合的核心序列，或探针过长形成复杂二级结构影响蛋白结合。建议查阅文献或用JASPAR、TRANSFAC、PROMO等数据库预测转录因子结合位点，确保探针包含预测的结合基序及两侧至少10-20bp侧翼序列。可设计多个重叠探针覆盖整个启动子区域。③核蛋白提取不当：核蛋白提取过程中蛋白降解或失活，或盐浓度过高导致蛋白变性。需加蛋白酶和磷酸酶抑制剂，冰上操作，优化核蛋白提取方法。④孵育条件不适宜：结合缓冲液的盐浓度、pH、去污剂浓度、温度、时间等条件可能不适合该蛋白-DNA相互作用。建议优化盐浓度（50-300mM NaCl梯度）、去污剂浓度（0-0.5% NP-40）、孵育温度（4°C或室温）和时间（1-4h或过夜）。加入poly(dI-dC)减少非特异性结合，但浓度过高可能抑制特异性结合，需优化（通常1-5μg/mL）。⑤蛋白与DNA的结合较弱或需要辅助因子：某些转录因子与DNA的结合较弱，或需要与其他蛋白形成二聚体/多聚体才能结合DNA（如AP-1需要c-Jun/c-Fos异二聚体），体外pull-down可能无法有效捕获。建议增加核蛋白用量、延长孵育时间、降低洗涤强度，或考虑使用交联后pull-down（先甲醛交联细胞，再提取核蛋白进行pull-down，稳定弱相互作用）。⑥WB检测抗体不适合：抗体无法识别变性后的目标蛋白，或抗体效价低。建议更换经WB验证的抗体，优化抗体稀释比例和孵育条件。⑦目标蛋白确实不与该DNA序列结合：排除技术问题后，可能目标蛋白与该DNA序列确实不存在直接结合，需重新评估研究假设。建议设置阳性对照（如已知结合的探针-蛋白对，如NF-κB探针+TNF-α处理细胞）验证实验体系是否正常，排除技术问题。