服务介绍
RIP-qPCR（RNA Immunoprecipitation followed by quantitative PCR，RNA免疫沉淀结合实时定量PCR）是一种在活细胞内研究蛋白质与RNA相互作用的经典实验技术，广泛应用于RNA结合蛋白（RBP）功能研究、miRNA靶基因验证、lncRNA/circRNA蛋白结合鉴定、mRNA转录后调控等RNA生物学研究领域。其基本原理与 ChIP-qPCR 类似，但研究对象从蛋白-DNA互作变为蛋白-RNA互作。在活细胞状态下用甲醛（formaldehyde）或紫外线（UV，254nm）交联处理细胞，将与RNA结合的蛋白质（如RNA结合蛋白、AGO2、核糖体蛋白等）与RNA共价交联固定，保存细胞内真实的蛋白-RNA结合状态。然后裂解细胞，加入针对目标RNA结合蛋白的特异性抗体进行免疫沉淀，抗体与目标蛋白结合后，通过Protein A/G磁珠将"目标蛋白-抗体-RNA"复合物沉淀下来，从而富集与目标蛋白结合的RNA。经过充分洗涤去除非特异性结合后，加热解交联，用蛋白酶K消化去除蛋白质，纯化得到免疫沉淀的RNA。**后，将RNA反转录为cDNA，使用针对目标RNA（mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA等）的特异性引物，通过实时定量PCR（qPCR）检测该RNA在免疫沉淀样品中的富集程度。
RIP-qPCR 结果通常以相对富集倍数（% Input 或 Fold Enrichment）表示，即免疫沉淀样品（IP）中目标RNA量相对于 Input（总RNA）或 IgG 阴性对照的富集比例。若 IP 组目标RNA的富集量显著高于 IgG 对照组，则证明目标RNA结合蛋白与该RNA存在特异性结合。实验必须设置三组对照：Input（交联后裂解的总RNA，阳性对照，反映总RNA量）、IP（加入目标蛋白特异性抗体的免疫沉淀组，实验组）、IgG（加入与一抗同物种同亚型的无关抗体，阴性对照，排除非特异性RNA结合）。根据交联方式不同，RIP 可分为交联RIP（cross-linked RIP）和天然RIP（native RIP）：交联RIP使用甲醛或紫外交联，适合稳定弱相互作用和瞬时相互作用，但可能影响抗体识别；天然RIP不交联，在温和条件下裂解细胞，适合稳定的蛋白-RNA复合物，操作更简单。与 RNA pull-down 等体外技术相比，RIP-qPCR 的核心优势在于能够在活细胞内真实生理状态下检测蛋白-RNA相互作用。其中，AGO2 RIP是验证miRNA靶基因的常用方法——AGO2是miRNA诱导沉默复合物（RISC）的核心蛋白，通过AGO2抗体RIP可富集与AGO2结合的miRNA及其靶mRNA，qPCR检测靶mRNA的富集即可验证miRNA与靶基因的结合。
图：RIP-qPCR RNA免疫沉淀实验原理与操作流程
服务优势
🧬
体内真实结合
在活细胞内交联固定蛋白-RNA复合物，反映真实生理状态下的结合，比体外实验更具生物学意义。
🔬
双交联方式可选
提供甲醛交联、紫外交联和天然RIP三种方式，根据蛋白-RNA互作强度和抗体特性选择**优方案。
📊
RNase-free严格操作
全程RNase-free操作，使用RNase抑制剂和无酶耗材，有效防止RNA降解，确保RIP实验成功率。
✅
对照设置严谨
每例实验均设置Input、IP、IgG三组对照，阳性对照（如AGO2+已知miRNA靶基因）验证体系，确保结果可靠。
服务流程
2
细胞交联与裂解
甲醛/紫外交联固定
RNase-free裂解细胞
3
抗体免疫沉淀
RBP特异性抗体孵育
Protein A/G磁珠沉淀
4
解交联与RNA纯化
65°C解交联
蛋白酶K消化纯化RNA
5
反转录与qPCR
RNA反转录cDNA
目标RNA qPCR定量
客户提供
样品与材料要求
细胞样品：需提供处于对数生长期的目标细胞，每个 RIP 反应需细胞量约 2-5×10⁶ 个（根据细胞类型和蛋白丰度调整）。
▶ 常规实验建议提供 5-10×10⁶ 个细胞/组（含Input、IP、IgG）；
▶ 细胞运输：活细胞培养瓶常温运输，或交联后细胞沉淀干冰运输（可委托我司交联）；
▶ 如需药物处理或基因干预，请提供处理后的细胞或详细处理方案。
抗体：需提供经 RIP 验证（RIP-validated / RIP-grade）的特异性抗体，抗体量 ≥ 5μg/RIP 反应（通常2-5μg，根据抗体效价调整），需提供抗体说明书或品牌货号。也可委托我司代购经RIP验证的抗体。
▶ RNA结合蛋白抗体：需确认可识别交联后或天然状态下的蛋白；
▶ AGO2抗体：推荐使用经RIP验证的AGO2单克隆或多克隆抗体（如Abcam ab57113、CST 2897等）。
qPCR引物：需提供目标RNA的qPCR引物序列，或委托我司设计合成。
▶ mRNA引物：覆盖目标基因CDS区或3'UTR区，产物长度80-200bp；
▶ miRNA引物：使用茎环反转录引物或加尾法引物；
▶ lncRNA/circRNA引物：需设计跨剪接位点或背靠背引物确保特异性。
实验信息：需提供目标RNA结合蛋白名称、基因 ID、目标RNA信息（mRNA/miRNA/lncRNA/circRNA名称和序列）、细胞类型、处理条件、检测RNA数量、交联方式偏好（甲醛/紫外/天然）、是否为AGO2 RIP-miRNA验证。
服务说明
| 服务名称 | 服务内容 | 交付内容及标准 | 服务周期(工作日) |
|---|
| RIP-qPCR 基本实验 | 细胞交联 | 甲醛或紫外交联固定蛋白-RNA复合物，甘氨酸终止交联 | 15 |
| 细胞裂解 | RNase-free条件裂解细胞，提取含蛋白-RNA复合物的裂解液 |
| 免疫沉淀 | 目标RBP抗体RIP，设Input、IP、IgG三组，Protein A/G磁珠沉淀，严格洗涤 |
| 解交联与RNA纯化 | 65°C解交联过夜，蛋白酶K消化，RNase-free条件纯化RNA |
| 反转录与qPCR | 3-5个目标RNA反转录qPCR定量，提供Ct值、溶解曲线、Input和Fold Enrichment计算、统计分析及实验报告 |
| RIP-qPCR 多位点检测 | 细胞交联与裂解 | 甲醛/紫外交联，RNase-free裂解细胞 | 18 |
| 免疫沉淀 | 目标RBP抗体RIP，设Input、IP、IgG三组，严格洗涤 |
| 解交联与RNA纯化 | 65°C解交联，蛋白酶K消化，纯化RNA |
| 多位点qPCR | 6-15个目标RNA（mRNA/miRNA/lncRNA）反转录qPCR定量检测 |
| 数据分析 | 提供各RNA相对富集柱状图、统计分析及详细实验报告 |
| AGO2 RIP-miRNA验证 | 细胞交联与裂解 | 甲醛交联，RNase-free裂解细胞 | 15 |
| AGO2 RIP | AGO2特异性抗体RIP，设Input、IP、IgG三组，严格洗涤 |
| 解交联与RNA纯化 | 65°C解交联，蛋白酶K消化，纯化RNA（含miRNA和mRNA） |
| miRNA靶基因qPCR | 目标miRNA及其预测靶mRNA的反转录qPCR定量，验证miRNA-AGO2-靶mRNA结合 |
| 数据分析 | 提供靶基因富集水平、相对定量分析、统计图表及详细实验报告 |
案例展示
研究利用 RIP-qPCR 技术验证了 RNA 结合蛋白 HuR（ELAVL1）与血管内皮生长因子（VEGF）mRNA 3'UTR 的直接结合及其对 mRNA 稳定性的调控。使用 HuR 抗体对常氧和缺氧处理的 HeLa 细胞进行 RIP，qPCR 检测 VEGF mRNA 3'UTR 区、CDS 区和 5'UTR 区的富集。结果显示，HuR RIP 样品中 VEGF mRNA 3'UTR 区富集量显著高于 IgG 对照组（Fold Enrichment = 12.6，P<0.001），而 CDS 区和 5'UTR 区富集较低，证明 HuR 特异性结合于 VEGF mRNA 的 3'UTR 区。缺氧处理后 HuR 与 VEGF mRNA 的结合增加了 3.2 倍，同时 VEGF mRNA 半衰期从 45min 延长至 120min。进一步构建 VEGF 3'UTR HuR 结合位点（ARE 元件）突变体质粒，RIP-qPCR 显示突变后 HuR 结合显著下降，VEGF mRNA 稳定性降低。该研究揭示了 HuR 通过结合 VEGF mRNA 3'UTR 的 ARE 元件增强 mRNA 稳定性，从而在缺氧条件下上调 VEGF 表达的分子机制。
利用 AGO2 RIP-qPCR 技术验证了 miR-21 与肿瘤抑制基因 PTEN mRNA 3'UTR 的直接结合。使用 AGO2 抗体对 miR-21 过表达和对照的 MCF-7 细胞进行 RIP，qPCR 检测 PTEN mRNA、已知 miR-21 靶基因 PDCD4 mRNA（阳性对照）和非靶基因 GAPDH mRNA（阴性对照）的富集。结果显示，在 miR-21 过表达细胞中，AGO2 RIP 样品中 PTEN mRNA 富集量显著高于对照细胞（Fold Enrichment = 5.8，P<0.01），阳性对照 PDCD4 mRNA 也显著富集（Fold Enrichment = 7.2），而阴性对照 GAPDH mRNA 无明显富集。IgG 对照组所有基因均无富集，排除了非特异性结合。同时，miR-21 抑制剂处理后，AGO2 RIP 中 PTEN mRNA 富集下降了 65%。结合双荧光素酶报告实验（PTEN 3'UTR 野生型荧光活性被 miR-21 抑制，突变型不受影响），证明 PTEN 是 miR-21 的直接靶基因。该研究为 miR-21 在乳腺癌中通过靶向 PTEN 促进肿瘤进展的机制提供了直接证据。
Q&A 常见问题
RIP-qPCR 与 ChIP-qPCR、RNA pull-down 有什么区别？该如何选择？
三者都是研究分子互作的技术，但研究对象不同：①ChIP-qPCR 研究蛋白-DNA互作（转录因子与DNA、组蛋白修饰），交联后用抗体沉淀蛋白结合的DNA，qPCR检测DNA富集；②RIP-qPCR 研究蛋白-RNA互作（RNA结合蛋白与RNA、AGO2与miRNA靶mRNA），交联后用抗体沉淀蛋白结合的RNA，反转录后qPCR检测RNA富集；③RNA pull-down 是体外实验，将体外转录的RNA（标记生物素）与细胞裂解液孵育，用链霉亲和素磁珠捕获RNA结合的蛋白，WB或质谱检测蛋白。选择原则：研究体内蛋白-RNA互作用 RIP-qPCR（金标准），研究体外RNA结合蛋白筛选或鉴定用 RNA pull-down，研究蛋白-DNA互作用 ChIP-qPCR。一般建议 RIP-qPCR 与 RNA pull-down 结合使用，体内体外双重验证结果更可靠。
RIP 实验甲醛交联和紫外交联如何选择？天然RIP又是什么？
RIP 实验有三种常用的交联/处理方式：①甲醛交联（formaldehyde cross-linking）：1%甲醛室温交联10-15min，甲醛是蛋白-蛋白和蛋白-RNA的双功能交联剂，交联效率高，可稳定弱相互作用和瞬时相互作用，但交联可能遮蔽抗体识别表位，且解交联需要65°C过夜；适合弱相互作用、瞬时相互作用和需要稳定复合物的实验；②紫外交联（UV cross-linking，254nm）：紫外照射细胞，主要在蛋白与RNA直接接触的位点形成共价键（零长度交联），特异性高，不产生蛋白-蛋白交联，对抗体识别影响小，但交联效率较低，需要优化照射能量和时间；适合直接蛋白-RNA接触的研究和抗体易受甲醛影响的实验；③天然RIP（native RIP，不交联）：不使用交联剂，在温和的非变性条件下裂解细胞，直接用抗体免疫沉淀天然状态的蛋白-RNA复合物，操作简单，不需要解交联步骤，RNA回收率高，但只能捕获稳定的蛋白-RNA复合物，弱相互作用和瞬时相互作用可能在裂解过程中解离；适合已知稳定结合的蛋白-RNA复合物（如核糖体蛋白与rRNA、稳定的RNP复合物）。选择原则：首次实验或互作强度未知时推荐甲醛交联（适用范围广）；抗体对甲醛敏感或需要高特异性时用紫外交联；已知稳定互作或需要简化操作时用天然RIP。南京高斯生物可根据蛋白和RNA特性推荐**优交联方式。
RIP 实验如何防止 RNA 降解？有哪些关键注意事项？
RNA 极易被 RNase 降解，RIP 实验的成功率很大程度上取决于 RNA 的完整性。防止 RNA 降解的关键措施：①全程 RNase-free 操作：使用无 RNase 的离心管、吸头、试剂，实验台面用 RNase ZAP 或 70% 乙醇清洁，佩戴无粉手套并经常更换；②裂解液中加入 RNase 抑制剂（如 RNasin、SUPERase·In），终浓度通常 100-200U/mL；③所有溶液用 DEPC 水或无 RNase 水配制，缓冲液高压灭菌后加入 RNase 抑制剂；④操作过程中保持低温（4°C或冰上），减少 RNase 活性；⑤避免反复冻融细胞和 RNA 样品；⑥交联后样品尽快进行后续实验，或 -80°C 保存但不宜超过1周；⑦纯化 RNA 后用 Nanodrop 检测浓度和纯度（A260/A280 应在1.8-2.1），必要时用生物分析仪检测 RNA 完整性（RIN值）；⑧设置阳性对照（如已知结合的蛋白-RNA对，如 AGO2+let-7a 靶基因、HuR+AU-rich 元件 mRNA）验证实验体系。南京高斯生物全程严格执行 RNase-free 操作标准，确保 RIP 实验成功率。
AGO2 RIP 为什么能验证 miRNA 靶基因？实验设计要点是什么？
AGO2（Argonaute 2）是 miRNA 诱导沉默复合物（RISC）的核心蛋白，miRNA 与 AGO2 结合后，通过种子序列互补识别靶 mRNA 的 3'UTR，形成 "miRNA-AGO2-靶mRNA" 三元复合物。因此，用 AGO2 抗体进行 RIP，可以同时富集与 AGO2 结合的 miRNA 和靶 mRNA。qPCR 检测靶 mRNA 在 AGO2 RIP 样品中的富集程度，即可判断该 mRNA 是否被 miRNA 招募到 RISC 复合物中，从而验证 miRNA 与靶基因的直接结合。AGO2 RIP 验证 miRNA 靶基因的实验设计要点：①设置 miRNA 过表达组（mimic）和对照组（mimic NC），比较两组中靶 mRNA 在 AGO2 RIP 中的富集差异——miRNA 过表达后靶 mRNA 在 AGO2 RIP 中富集增加，证明 miRNA 促进了靶 mRNA 与 AGO2 的结合；②设置 miRNA 抑制剂组（inhibitor）作为反向验证——抑制剂处理后靶 mRNA 在 AGO2 RIP 中富集下降；③设置阳性对照（已知的 miRNA 靶基因，如 miR-21+PDCD4、let-7+HMGA2）和阴性对照（非靶基因，如 GAPDH、β-actin）；④qPCR 引物设计在靶基因的 3'UTR 区或 CDS 区，避免引物结合位点被 miRNA 结合位点覆盖；⑤结合双荧光素酶报告实验（野生型和突变型 3'UTR）进行双重验证，结果更有说服力。AGO2 RIP 是目前验证 miRNA 靶基因**直接的体内方法之一。
RIP 实验阴性结果（IP 与 IgG 无显著差异）可能是什么原因？
RIP 实验阴性结果可能原因包括：①目标蛋白与目标RNA确实不存在直接结合（可能是间接结合，需要中间蛋白或RNA介导，交联RIP可能无法有效固定间接复合物）；②抗体不适合 RIP，无法识别交联后或天然状态下的蛋白，建议更换经 RIP 验证的抗体或增加抗体用量；③细胞量不足或目标蛋白/RNA表达量低，RIP 信号低于检测限，建议增加细胞量（至1×10⁷以上/反应）或选择高表达的细胞系/处理条件；④交联条件不当，甲醛交联时间过短（蛋白-RNA未充分固定）或过长（表位被遮蔽、RNA断裂），通常1%甲醛室温交联10-15min，需优化；紫外交联能量不足或过度，需优化照射时间和距离；⑤RNA降解导致信号丢失，全程需 RNase-free 操作，加 RNase 抑制剂；⑥洗涤条件过于严格，洗去了特异性结合复合物，建议降低洗涤液盐浓度或减少洗涤次数；⑦qPCR引物设计不当或效率低，建议重新设计引物、验证引物效率（90-110%）、确保引物特异性；⑧目标RNA与蛋白的结合是瞬时或弱相互作用，天然RIP无法捕获，建议改用甲醛或紫外交联RIP；⑨裂解液条件不当，盐浓度过高或去污剂过强破坏了蛋白-RNA复合物，建议优化裂解液成分。建议设置阳性对照（如AGO2+已知miRNA靶基因、HuR+ARE mRNA）验证实验体系是否正常，排除技术问题。
