服务介绍
ChIP-qPCR（Chromatin Immunoprecipitation followed by quantitative PCR，染色质免疫沉淀结合实时定量PCR）是一种在活细胞内研究蛋白质与DNA相互作用的经典实验技术，广泛应用于转录因子结合位点验证、组蛋白修饰图谱分析、启动子/增强子功能鉴定等表观遗传学研究领域。其基本原理是：在活细胞状态下用甲醛（formaldehyde）等交联剂处理细胞，将与DNA结合的蛋白质（如转录因子、组蛋白、染色质重塑因子等）与DNA共价交联固定，从而保存细胞内真实的蛋白-DNA结合状态。然后裂解细胞，提取细胞核，通过超声波将长链染色质破碎为长度约200-500bp的小片段。加入针对目标蛋白的特异性抗体进行免疫沉淀，抗体与目标蛋白结合后，通过Protein A/G磁珠将"目标蛋白-抗体-DNA片段"复合物沉淀下来，从而富集与目标蛋白结合的DNA片段。经过充分洗涤去除非特异性结合后，加热解交联（65°C过夜），用蛋白酶K消化去除蛋白质，纯化得到免疫沉淀的DNA。**后，使用针对目标基因启动子、增强子或特定基因组区域的特异性引物，通过实时定量PCR（qPCR）检测该区域DNA在免疫沉淀样品中的富集程度。
ChIP-qPCR 结果通常以相对富集倍数（% Input 或 Fold Enrichment）表示，即免疫沉淀样品（IP）中目标区域DNA量相对于 Input（总染色质DNA）或 IgG 阴性对照的富集比例。若 IP 组目标区域的 DNA 富集量显著高于 IgG 对照组，则证明目标蛋白在该基因组区域存在特异性结合。实验必须设置三组对照：Input（交联后破碎的总染色质DNA，阳性对照，反映总DNA量）、IP（加入目标蛋白特异性抗体的免疫沉淀组，实验组）、IgG（加入与一抗同物种同亚型的无关抗体，阴性对照，排除非特异性DNA结合）。与 EMSA 等体外技术相比，ChIP-qPCR 的核心优势在于能够在活细胞内真实生理状态下检测蛋白-DNA相互作用，反映体内染色质环境下的结合情况。
图：ChIP-qPCR 染色质免疫沉淀实验原理与操作流程
服务优势
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体内真实结合
在活细胞内甲醛交联固定蛋白-DNA复合物，反映真实生理状态下的结合，比体外实验更具生物学意义。
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超声条件优化
针对不同细胞类型优化超声破碎条件（功率、时间、循环数），确保染色质片段集中在200-500bp，提高ChIP效率。
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qPCR精确定量
使用SYBR Green或TaqMan探针法qPCR，引物效率验证，提供Ct值、溶解曲线、相对富集定量及统计学分析。
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对照设置严谨
每例实验均设置Input、IP、IgG三组对照，阳性对照抗体（如H3K4me3、RNA Pol II）验证实验体系，确保结果可靠。
服务流程
3
染色质超声破碎
超声剪切染色质
片段200-500bp
4
抗体免疫沉淀
特异性抗体孵育
Protein A/G磁珠沉淀
5
解交联与DNA纯化
65°C解交联
蛋白酶K消化纯化DNA
6
qPCR检测与交付
目标区域qPCR定量
数据分析报告交付
客户提供
样品与材料要求
细胞样品：需提供处于对数生长期的目标细胞，每个 ChIP 反应需细胞量约 1-2×10⁶ 个（根据细胞类型和蛋白丰度调整）。
▶ 常规实验建议提供 3-5×10⁶ 个细胞/组（含Input、IP、IgG）；
▶ 细胞运输：活细胞培养瓶常温运输，或交联后细胞沉淀干冰运输（可委托我司交联）；
▶ 如需药物处理或基因干预，请提供处理后的细胞或详细处理方案。
抗体：需提供经 ChIP 验证（ChIP-validated）的特异性抗体，抗体量 ≥ 5μg/ChIP 反应（通常2-5μg，根据抗体效价调整），需提供抗体说明书或品牌货号。也可委托我司代购经ChIP验证的抗体。
▶ 转录因子抗体：需确认可识别交联后天然构象的蛋白；
▶ 组蛋白修饰抗体：如H3K4me3、H3K27ac、H3K27me3等，需特异性好、批次稳定。
qPCR引物：需提供目标基因区域的qPCR引物序列，或委托我司设计合成。引物设计需覆盖目标启动子/增强子区域，产物长度建议80-200bp。建议同时设计阴性对照区域引物（如基因 desert 区域）。
实验信息：需提供目标蛋白名称、基因 ID、目标基因/区域信息（转录起始位点位置、预测结合位点）、细胞类型、处理条件、检测位点数量、是否需要阳性对照抗体。
服务说明
| 服务名称 | 服务内容 | 交付内容及标准 | 服务周期(工作日) |
|---|
| ChIP-qPCR 基本实验 | 细胞交联 | 甲醛交联固定蛋白-DNA复合物，甘氨酸终止交联 | 15 |
| 染色质破碎 | 细胞核提取，超声破碎染色质至200-500bp，琼脂糖电泳验证片段大小 |
| 免疫沉淀 | 目标蛋白抗体ChIP，设Input、IP、IgG三组，Protein A/G磁珠沉淀，严格洗涤 |
| 解交联纯化 | 65°C解交联过夜，蛋白酶K消化，DNA纯化回收 |
| qPCR检测 | 3-5个目标位点qPCR定量，提供Ct值、溶解曲线、%Input和Fold Enrichment计算、统计分析及实验报告 |
| ChIP-qPCR 多位点检测 | 细胞交联与破碎 | 甲醛交联，超声破碎染色质至200-500bp，验证片段大小 | 18 |
| 免疫沉淀 | 目标蛋白抗体ChIP，设Input、IP、IgG三组，严格洗涤 |
| 解交联纯化 | 65°C解交联，蛋白酶K消化，DNA纯化 |
| 多位点qPCR | 6-15个目标位点qPCR定量（含启动子截短、增强子、阴性对照区域） |
| 数据分析 | 提供各位点相对富集柱状图、区域富集图谱、统计分析及详细实验报告 |
| 组蛋白修饰 ChIP-qPCR | 细胞交联与破碎 | 甲醛交联，超声破碎染色质至200-500bp | 15 |
| 组蛋白修饰ChIP | 组蛋白修饰抗体（如H3K4me3、H3K27ac、H3K27me3等）ChIP，设Input、IP、IgG |
| 阳性对照 | 提供H3（总组蛋白）或已知修饰富集位点阳性对照，验证ChIP体系 |
| 解交联纯化 | 65°C解交联，蛋白酶K消化，DNA纯化 |
| qPCR检测分析 | 目标基因区域qPCR定量，提供修饰富集水平、相对定量分析及实验报告 |
案例展示
研究利用 ChIP-qPCR 技术验证了缺氧条件下转录因子 HIF-1α 与血管内皮生长因子（VEGF）基因启动子区缺氧响应元件（HRE）的结合动态。使用 HIF-1α 抗体对常氧（21% O₂）和缺氧（1% O₂）处理 6h 的 HepG2 细胞进行 ChIP，qPCR 检测 VEGF 启动子区三个 HRE 位点（HRE-1、HRE-2、HRE-3）及阴性对照区域（基因 desert）的 DNA 富集。结果显示，缺氧处理后 HIF-1α 在 HRE-1 和 HRE-2 位点的富集分别增加了 8.3 倍和 5.7 倍（P<0.001），而 HRE-3 和阴性对照区域无显著富集变化，证明 HIF-1α 特异性结合于 VEGF 启动子的 HRE-1 和 HRE-2 位点。IgG 对照组所有位点均无明显富集，排除了非特异性结合。该研究为缺氧诱导 VEGF 表达的转录调控机制提供了直接的体内证据。
利用组蛋白修饰 ChIP-qPCR 技术研究了肿瘤细胞中 p16（CDKN2A）基因启动子区抑制性组蛋白标记 H3K27me3 的富集水平与基因沉默的关系。使用 H3K27me3 抗体对正常乳腺上皮细胞（HMEC）和乳腺癌细胞系（MCF-7、MDA-MB-231）进行 ChIP，qPCR 检测 p16 启动子区转录起始位点（TSS）上游 -2000bp 至下游 +500bp 共 8 个位点的 H3K27me3 富集。结果显示，在 p16 表达沉默的 MDA-MB-231 细胞中，p16 启动子 TSS 附近 -500bp 至 +200bp 区域 H3K27me3 富集水平显著高于 p16 表达正常的 HMEC 细胞（平均富集倍数 6.2 倍，P<0.01），而在 p16 部分表达的 MCF-7 细胞中富集水平居中。同时检测活性标记 H3K4me3，发现其富集模式与 H3K27me3 呈负相关。使用 EZH2 抑制剂 GSK126 处理 MDA-MB-231 细胞后，p16 启动子 H3K27me3 水平下降，p16 mRNA 表达恢复，证明 H3K27me3 介导了 p16 基因的表观遗传沉默。
Q&A 常见问题
ChIP-qPCR 与 EMSA 有什么区别？该如何选择？
EMSA（凝胶迁移实验）是体外实验，将纯化的核蛋白与合成的核酸探针在体外孵育，检测蛋白与特定DNA序列的结合能力，操作相对简单，适合验证已知序列的结合，但无法反映体内染色质环境（如核小体定位、其他蛋白协同结合）的影响。ChIP-qPCR 是体内实验，在活细胞内用甲醛交联固定蛋白-DNA复合物，然后用抗体沉淀，反映细胞内真实生理状态下蛋白与染色质DNA的结合，更具生物学意义，但操作更复杂，需要ChIP级别的抗体和足够的细胞量。一般建议：先用 EMSA 做体外序列特异性验证，再用 ChIP-qPCR 做体内结合验证，两者结合结果更有说服力。如果研究关注体内染色质环境下的结合或组蛋白修饰，必须使用 ChIP-qPCR。
ChIP 实验对抗体有什么特殊要求？普通WB抗体可以用吗？
ChIP 实验对抗体的要求比 WB 更高，不是所有抗体都适合 ChIP。核心要求是：抗体必须能够识别甲醛交联后染色质中目标蛋白的天然构象表位。很多 WB 抗体只能识别变性后线性表位的蛋白（SDS煮沸变性后），在交联后的天然构象下无法结合，因此不适合 ChIP。选择 ChIP 抗体的原则：①优先选择经 ChIP 验证（ChIP-validated / ChIP-grade）的抗体，查阅抗体说明书或文献确认其 ChIP 适用性；②多克隆抗体通常比单克隆抗体更适合 ChIP（识别多个表位，交联后仍有表位暴露）；③组蛋白修饰抗体需选择特异性好、批次验证的优质抗体（如 Active Motif、Abcam、CST 等品牌的 ChIP 级抗体）；④如果没有经 ChIP 验证的抗体，可**行预实验测试，设置阳性对照（如已知结合的位点）验证抗体效果；⑤抗体用量需优化，通常 2-5μg/ChIP 反应，过多反而增加非特异性背景。南京高斯生物可根据目标蛋白推荐合适的 ChIP 级抗体。
ChIP 实验超声破碎条件如何优化？片段大小为什么很重要？
超声破碎是 ChIP 实验的关键步骤，直接影响 ChIP 效率和结果分辨率。染色质片段大小的重要性：①片段过大（>1000bp）：分辨率低，无法精确定位蛋白结合位点，且可能包含多个基因区域，导致qPCR结果不准确；②片段过小（<100bp）：可能破坏蛋白-DNA结合或抗体识别表位，降低ChIP效率；③理想片段大小为200-500bp，兼顾分辨率和ChIP效率。超声条件优化需考虑：①细胞类型：不同细胞的染色质致密程度不同，血细胞较易破碎，肿瘤细胞和原代细胞可能需要更强超声；②超声功率：通常使用30-40%**大功率，避免过高功率导致样本过热（需冰浴）；③超声时间和循环：通常采用"超声30秒-冰浴60秒"循环，重复8-15次，需根据细胞量和类型调整；④样本浓度：细胞浓度过高会导致破碎不均匀；⑤验证：每次超声后取少量样本解交联纯化DNA，琼脂糖凝胶电泳验证片段大小分布，确保主条带在200-500bp。南京高斯生物针对常见细胞系已建立优化的超声条件，并对每个新细胞类型进行预实验优化。
ChIP-qPCR 结果如何分析？%Input 和 Fold Enrichment 有什么区别？
ChIP-qPCR 结果通常有两种定量表示方法：①% Input（占总染色质的百分比）：将 IP 样品的 Ct 值与 Input 样品（通常取总染色质的1%或10%）的 Ct 值比较，计算 IP 样品中目标区域 DNA 量占总 Input DNA 量的百分比。计算公式：% Input = 2^[Ct(Input) - Ct(IP)] × Input 稀释倍数 × 100%。% Input 反映了目标蛋白在该位点的实际结合丰度，数值通常在0.1%-10%之间（转录因子通常较低，组蛋白修饰较高）。②Fold Enrichment（富集倍数）：将 IP 样品的目标区域 DNA 量与 IgG 阴性对照样品的同区域 DNA 量比较，计算 IP 相对于 IgG 的富集倍数。计算公式：Fold Enrichment = 2^[Ct(IgG) - Ct(IP)]。Fold Enrichment 反映了特异性结合相对于非特异性背景的富集程度，通常 >2-3 倍认为有特异性结合。两种方法的区别：% Input 是绝对值，反映实际结合丰度，适合比较不同蛋白或不同位点的结合水平；Fold Enrichment 是相对值，反映信噪比，适合判断结合是否具有特异性。高质量的 ChIP 结果应同时报告 % Input 和 Fold Enrichment，并设置阴性对照区域（如基因 desert）验证特异性。南京高斯生物提供完整的 qPCR 数据分析，包括 Ct 值、溶解曲线、% Input、Fold Enrichment、统计图表和详细实验报告。
ChIP 实验阴性结果（IP 与 IgG 无显著差异）可能是什么原因？
ChIP 实验阴性结果可能原因包括：①目标蛋白在该细胞/条件下确实不结合目标区域（如转录因子未被激活、未入核、该位点无结合基序）；②抗体不适合 ChIP，无法识别交联后蛋白，建议更换经 ChIP 验证的抗体或增加抗体用量；③细胞量不足或目标蛋白表达量低，ChIP 信号低于检测限，建议增加细胞量（至5×10⁶以上/反应）或选择蛋白高表达的细胞系/处理条件；④超声破碎条件不佳，片段过大或过小，影响抗体结合和 DNA 回收，建议优化超声条件，验证片段大小；⑤交联条件不当，甲醛交联时间过短（蛋白-DNA未充分固定）或过长（表位被遮蔽），通常1%甲醛室温交联10-15min，需优化；⑥洗涤条件过于严格，洗去了特异性结合蛋白，建议降低洗涤液盐浓度或减少洗涤次数；⑦qPCR引物设计不当，引物效率低或扩增非特异产物，建议重新设计引物、验证引物效率（90-110%）；⑧目标蛋白与DNA的结合是间接的（通过其他蛋白介导），甲醛交联可能无法有效固定间接结合的复合物，建议使用更强的交联剂（如DSG+甲醛双交联）。建议设置阳性对照（如已知结合的抗体和位点，如RNA Pol II、H3K4me3）验证实验体系是否正常，排除技术问题。
