服务介绍
GST pull-down（谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白沉淀实验，Glutathione S-transferase pull-down）是一种广泛应用的体外蛋白质相互作用研究技术。其基本原理是：将靶蛋白 A（诱饵蛋白）的编码序列与 GST（谷胱甘肽S-转移酶）标签融合，构建原核表达载体，在大肠杆菌中诱导表达 GST-A 融合蛋白，通过谷胱甘肽亲和层析纯化。将纯化的 GST-A 融合蛋白固定在谷胱甘肽磁珠（或琼脂糖珠）上，GST 标签与磁珠表面的谷胱甘肽发生特异性结合，靶蛋白 A 朝外暴露。然后加入含有猎物蛋白 B 的细胞裂解液、组织裂解液或纯化蛋白，在适宜条件下孵育，若蛋白 A 与蛋白 B 存在相互作用，则猎物蛋白 B 被 GST-A 捕获并随磁珠沉淀。经过充分洗涤去除非特异性结合蛋白后，用还原型谷胱甘肽洗脱或 SDS 上样缓冲液煮沸洗脱，**后通过 Western Blot 检测已知候选蛋白 B，或通过质谱（LC-MS/MS）鉴定所有被捕获的互作蛋白。
Halo pull-down 是 GST pull-down 的改进技术，使用 HaloTag（一种源自细菌脱卤素酶的自标记蛋白标签）替代 GST 标签。HaloTag 可以与氯烷烃配体发生高效、特异的共价结合，将 HaloTag-靶蛋白融合蛋白固定在氯烷烃磁珠上。与 GST pull-down 相比，Halo pull-down 的优势在于：共价结合更稳定，可耐受更严格的洗涤条件（高盐、去污剂），有效降低非特异性背景；洗脱条件更灵活，可通过蛋白酶切或特异性竞争洗脱，减少标签干扰；蛋白固定方向更均一，有利于蛋白互作。两种技术均需设置阴性对照（如单独 GST/Halo 标签蛋白、无关蛋白融合）以排除非特异性结合。
图：GST / Halo pull-down 实验原理与操作流程
服务优势
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蛋白表达纯化能力强
具备成熟的原核表达体系，可优化诱导条件（温度、IPTG浓度、时间），提高可溶性蛋白表达量。
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双技术平台可选
提供GST pull-down和Halo pull-down两种技术平台，HaloTag共价结合更稳定，洗涤条件更严格，背景更低。
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WB与质谱双检测
可根据实验需求选择Western Blot检测已知候选蛋白，或LC-MS/MS质谱鉴定所有未知互作蛋白。
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对照设置严谨
每例实验均设置GST/Halo空标签阴性对照、Input阳性对照，有效排除非特异性结合，确保结果可靠。
服务流程
2
融合载体构建
GST/Halo融合载体构建
测序验证
4
pull-down孵育
磁珠固定融合蛋白
与猎物蛋白孵育
客户提供
样品与材料要求
诱饵蛋白基因：需提供靶蛋白（诱饵蛋白）的基因序列（CDS区）或 cDNA 模板。如提供 cDNA，需确保序列正确并包含完整编码区。也可委托我司根据基因 ID 合成克隆。
猎物蛋白来源：
▶ 细胞裂解液：≥ 5×10⁶ 个细胞制备的裂解液，蛋白总量 ≥ 500μg，干冰运输；
▶ 组织裂解液：动物组织 ≥ 0.5g 或植物组织 ≥ 1g 制备的裂解液，干冰运输；
▶ 纯化蛋白：≥ 50μg 纯化猎物蛋白，浓度 ≥ 0.5μg/μL，干冰运输；
▶ 也可提供细胞/组织样品，委托我司制备裂解液。
抗体（WB检测）：如需 Western Blot 检测已知候选猎物蛋白，需提供猎物蛋白抗体，抗体量 ≥ 10μL/次，需提供抗体说明书或品牌货号。也可委托我司代购。
实验信息：需提供诱饵蛋白和猎物蛋白名称、基因 ID、实验目的（验证已知互作/筛选未知互作）、检测方式（WB/质谱）、是否需要 Halo pull-down 替代 GST pull-down。
服务说明
| 服务名称 | 服务内容 | 交付内容及标准 | 服务周期(工作日) |
|---|
| GST pull-down-WB | 载体构建 | 构建GST-诱饵蛋白融合表达载体，测序验证 | 18 |
| 蛋白表达纯化 | 原核诱导表达GST融合蛋白，谷胱甘肽亲和纯化，SDS-PAGE鉴定纯度 |
| pull-down实验 | GST融合蛋白固定磁珠，与猎物蛋白裂解液孵育，设GST空标签阴性对照 |
| 洗涤洗脱 | 洗涤3-5次去除非特异结合，还原型谷胱甘肽洗脱或SDS煮沸洗脱 |
| WB检测 | Western Blot检测候选猎物蛋白，提供原始图片、灰度定量分析及实验报告 |
| GST pull-down-MS | 载体构建与纯化 | 构建GST融合载体，原核表达纯化，SDS-PAGE鉴定 | 28 |
| pull-down实验 | 实验组和GST阴性对照组各pull-down一次，收集洗脱蛋白 |
| SDS-PAGE分离 | 洗脱蛋白SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝或银染显色 |
| 质谱鉴定 | 差异条带切胶酶解，LC-MS/MS质谱鉴定，提供互作蛋白列表 |
| 生物信息学分析 | GO功能注释、KEGG通路富集、蛋白互作网络分析（可选） |
| Halo pull-down-WB | 载体构建 | 构建HaloTag-诱饵蛋白融合表达载体，测序验证 | 20 |
| 蛋白表达纯化 | 原核诱导表达Halo融合蛋白，氯烷烃磁珠纯化或亲和纯化 |
| pull-down实验 | Halo融合蛋白共价固定氯烷烃磁珠，与猎物蛋白孵育，设Halo空标签对照 |
| 严格洗涤洗脱 | 高盐/去污剂严格洗涤降低背景，蛋白酶切或SDS洗脱 |
| WB检测 | Western Blot检测候选猎物蛋白，提供原始图片、定量分析及实验报告 |
案例展示
研究利用 GST pull-down 技术验证了新冠病毒核衣壳蛋白（N蛋白）与宿主应激颗粒关键蛋白 G3BP1 的直接相互作用。构建 GST-N 蛋白融合表达载体，在大肠杆菌中诱导表达并纯化 GST-N 蛋白，固定在谷胱甘肽磁珠上。与 HEK293T 细胞裂解液孵育后，Western Blot 检测发现 GST-N 组可显著富集 G3BP1 蛋白，而 GST 空标签对照组无明显条带，证明 N 蛋白与 G3BP1 存在特异性结合。进一步的截短体 pull-down 实验定位了 N 蛋白的 N 端结构域（1-180aa）是与 G3BP1 结合的关键区域。该研究揭示了新冠病毒 N 蛋白通过结合 G3BP1 抑制宿主应激颗粒形成的免疫逃逸机制。
利用 Halo pull-down 结合 LC-MS/MS 质谱技术，系统鉴定了肿瘤抑制因子 VHL（von Hippel-Lindau）蛋白的新型互作蛋白组。构建 HaloTag-VHL 融合表达载体，纯化后共价固定在氯烷烃磁珠上。与肾癌细胞系 786-O 裂解液孵育，经过高盐（500mM NaCl）和 0.1% NP-40 严格洗涤后，洗脱结合蛋白并进行 SDS-PAGE 分离和质谱鉴定。与 HaloTag 空标签对照组比较，共鉴定出 47 个 VHL 特异性互作蛋白，其中包括已知的 HIF-1α、Elongin B/C 等经典互作蛋白，以及 23 个尚未报道的新型互作蛋白。GO 富集分析显示这些互作蛋白主要参与缺氧应答、蛋白泛素化、细胞周期调控等生物学过程。该研究为 VHL 肿瘤抑制功能的机制研究提供了新的候选靶点。
Q&A 常见问题
GST pull-down 与 Co-IP 有什么区别？该如何选择？
GST pull-down 是体外实验，将纯化的 GST 融合诱饵蛋白与细胞裂解液在体外孵育，检测蛋白间的直接或间接相互作用，操作相对简单，适合初步筛选和验证，且可控制蛋白浓度和反应条件。Co-IP 是体内（或近体内）实验，在非变性条件下裂解细胞后用内源性蛋白的抗体沉淀，反映细胞内接近生理状态的蛋白互作，但需要 IP 级别的抗体。一般建议：先用 GST pull-down 做体外初筛和验证，再用 Co-IP 做体内验证，两者结合结果更有说服力。如果没有合适的 IP 抗体，GST pull-down 是更好的选择。
GST 标签会影响蛋白互作吗？如何排除标签干扰？
GST 标签（约26kDa）分子量较大，可能通过空间位阻影响诱饵蛋白的折叠或互作结构域的暴露，从而影响蛋白互作。排除方法：①设置严格的 GST 空标签阴性对照，即单独表达纯化 GST 蛋白进行平行 pull-down，若 GST 对照组也能捕获猎物蛋白，则说明存在标签介导的非特异性结合；②选择合适的融合方向，将 GST 标签融合在不影响蛋白互作结构域的一端（N端或C端），必要时同时构建两种融合方向进行比较；③在诱饵蛋白和 GST 标签之间引入柔性连接肽（如 GGGGS 重复序列），减少空间位阻；④可考虑使用更小的标签（如 His-tag、FLAG-tag）或 HaloTag 替代 GST。
Halo pull-down 相比 GST pull-down 有什么优势？
Halo pull-down 的核心优势在于 HaloTag 与氯烷烃配体的结合是共价键，而 GST 与谷胱甘肽是非共价的亲和结合。具体优势包括：①结合更稳定，可耐受更严格的洗涤条件（高盐至500mM-1M NaCl、0.1%-0.5% NP-40/Triton X-100 等去污剂），有效去除非特异性结合蛋白，降低背景；②共价结合不可逆，洗涤过程中不会发生诱饵蛋白解离流失，提高实验重复性；③蛋白固定方向更均一，HaloTag 通过特定活性位点共价结合，所有融合蛋白以相同方向固定在磁珠上，有利于互作结构域暴露；④洗脱更灵活，可通过位点特异性蛋白酶（如 TEV、Thrombin）切下诱饵蛋白-猎物蛋白复合物，避免 GST 标签和磁珠成分干扰后续检测；⑤HaloTag 标签（约33kDa）虽比 GST 略大，但共价结合的稳定性优势显著。对于高背景、难洗涤的样本，推荐使用 Halo pull-down。
GST 融合蛋白表达为包涵体（不溶）怎么办？
GST 融合蛋白在大肠杆菌中表达时，部分蛋白（尤其是真核蛋白、膜蛋白、大分子量蛋白）容易形成不溶性包涵体，无法直接用于 pull-down 实验。解决方法：①降低诱导温度（从37°C降至16-25°C），减缓蛋白合成速率，促进正确折叠；②降低 IPTG 浓度（从1mM降至0.1-0.5mM），减少过表达导致的聚集；③延长诱导时间（低温诱导16-24h）；④更换表达菌株，如使用 Origami B（有利于二硫键形成）、SHuffle（促进胞质内二硫键形成）等特殊菌株；⑤优化裂解缓冲液，添加温和去污剂（如0.1% Triton X-100）、助溶剂（如山梨醇、甘油）或分子伴侣共表达；⑥如以上方法均无效，可考虑包涵体变性复性（8M尿素变性后梯度透析复性），但复性效率较低且可能影响蛋白功能；⑦对于难以原核表达的蛋白，可改用真核表达系统（如昆虫细胞 Sf9、哺乳动物细胞 HEK293）表达纯化，或改用 Co-IP 等不需要纯化诱饵蛋白的技术。南京高斯生物可根据蛋白特性优化表达条件，提高可溶性蛋白产量。
GST pull-down 实验阴性结果（未检测到互作）可能是什么原因？
GST pull-down 阴性结果可能原因包括：①两个蛋白确实不存在直接相互作用（可能是间接互作，需要中间蛋白介导，体外纯化体系中缺少中间蛋白则无法检测到）；②GST 融合诱饵蛋白折叠不正确或互作结构域被标签遮挡，建议优化融合方向或引入连接肽；③诱饵蛋白表达纯化过程中失活（如反复冻融、纯化条件剧烈），建议新鲜纯化并尽快使用；④猎物蛋白在裂解液中表达量低或已降解，建议增加上样量、优化裂解条件、加蛋白酶抑制剂；⑤孵育条件不适宜（缓冲液 pH、盐浓度、温度、时间等），建议优化孵育条件（如4°C过夜孵育、调整 NaCl 浓度至150-300mM）；⑥洗涤过于严格导致弱互作被洗掉，建议减少洗涤次数或降低洗涤液盐浓度；⑦蛋白间互作较弱（KD值较高），体外 pull-down 灵敏度不足，建议改用更灵敏的方法（如 Co-IP、FRET、BiFC）或增加蛋白浓度。建议设置阳性对照（已知互作的蛋白对）以排除实验体系问题。
