服务介绍
BiFC（Bimolecular Fluorescence Complementation，双分子荧光互补）是一种基于荧光蛋白片段重组的活细胞内蛋白质相互作用检测技术。其基本原理是：将一个完整的荧光蛋白（如 YFP、GFP、CFP 等）在特定位点拆分为 N 端片段（YN）和 C 端片段（YC），两个片段单独存在时均无荧光活性。将 YN 与待测蛋白 A 融合、YC 与待测蛋白 B 融合，构建两个融合表达载体并共转染至同一细胞中。若蛋白 A 与蛋白 B 存在相互作用，两者的结合会将 YN 和 YC 片段在空间上拉近，促使两个片段重新折叠组装成完整的有功能的荧光蛋白，从而发出荧光。通过荧光显微镜或流式细胞仪检测荧光信号的有无和强度，即可判断蛋白间是否存在相互作用及互作的强弱。
BiFC 技术的核心优势在于能够在活细胞内实时、直观地观察蛋白质相互作用，不仅可以检测互作的发生，还能确定互作发生的亚细胞定位，并可动态观察药物处理、信号刺激等条件下蛋白互作的变化。与 Co-IP 等体外验证技术相比，BiFC 更接近生理环境，且具有可视化、可定量、可动态观察等特点。实验需设置阴性对照（如蛋白突变体、无关蛋白融合）以排除荧光片段自组装导致的假阳性。
图：BiFC 双分子荧光互补实验原理与操作流程
服务优势
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活细胞内检测
在活细胞生理环境下检测蛋白互作，更接近真实生物学状态，无需裂解细胞。
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亚细胞定位
可直观观察蛋白互作发生的亚细胞位置（细胞核、细胞质、细胞膜等），提供空间信息。
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实时动态观察
可动态观察药物处理、信号刺激等条件下蛋白互作的时间动态变化，适合机制研究。
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交付内容完整
提供荧光显微镜图片、流式细胞仪定量数据、共定位分析及详细实验报告，可直接用于论文。
服务流程
1
接收订单及序列
确认实验方案
接收基因序列/cDNA
客户提供
样品与材料要求
基因序列：需提供两个待测蛋白的基因序列（CDS区）或 cDNA 模板。如提供 cDNA，需确保序列正确并包含完整编码区。也可委托我司根据基因 ID 合成克隆。
细胞系：需提供目标细胞系，细胞状态良好，无污染。
▶ 易转染细胞（如 HEK293、Hela）推荐使用；
▶ 难转染细胞（原代细胞、悬浮细胞等）需提前说明，以便优化转染条件；
▶ 细胞运输：活细胞培养瓶常温运输，或冻存细胞干冰运输。
实验信息：需提供两个目标蛋白名称、基因 ID、融合方向（N端融合/C端融合，需根据蛋白结构和功能选择）、是否需要共定位分析、是否需要药物处理或时间梯度观察。
处理因素（可选）：如涉及药物处理、信号刺激等，需提供药物或刺激因子，并说明处理浓度和时间。
服务说明
| 服务名称 | 服务内容 | 交付内容及标准 | 服务周期(工作日) |
|---|
| BiFC 基本实验 | 载体构建 | 构建蛋白A-YN和蛋白B-YC两个融合表达载体，测序验证 | 18 |
| 质粒制备 | 无内毒素质粒大提，满足细胞转染要求 |
| 细胞共转染 | 两个融合载体共转染目标细胞，设阴性对照（突变体/无关蛋白） |
| 荧光检测 | 荧光显微镜成像（明场+荧光通道），流式细胞仪荧光强度定量 |
| 结果分析 | 提供荧光图片、流式定量数据、荧光强度统计分析及实验报告 |
| BiFC 共定位分析 | 载体构建 | 构建BiFC融合载体及细胞器标记载体（细胞核/内质网/线粒体等） | 20 |
| 共转染 | BiFC载体与细胞器标记载体共转染，设阴性对照 |
| 多通道成像 | 激光共聚焦显微镜多通道成像（BiFC荧光+细胞器标记+明场） |
| 共定位分析 | Pearson相关系数分析，确定互作发生的亚细胞定位 |
| 结果交付 | 提供共聚焦图片、共定位定量数据、统计分析及实验报告 |
| BiFC 药物处理 | 载体构建与转染 | 构建BiFC融合载体，共转染目标细胞 | 22 |
| 药物处理 | 按实验方案进行药物浓度梯度或时间梯度处理 |
| 动态荧光检测 | 不同时间点荧光显微镜成像或流式细胞仪检测，观察互作动态变化 |
| 定量分析 | 荧光强度随时间/浓度变化曲线，统计分析药物对互作的影响 |
| 结果交付 | 提供动态荧光图片、定量曲线、统计分析及实验报告 |
案例展示
研究利用 BiFC 技术在活细胞内实时观察了肿瘤抑制因子 p53 与 E3 泛素连接酶 MDM2 的相互作用。将 YFP 的 N 端片段与 p53 融合、C 端片段与 MDM2 融合，共转染 Hela 细胞后，荧光显微镜下观察到明显的黄色荧光，且荧光信号主要定位于细胞核内，与 DAPI 染色共定位，证明 p53 与 MDM2 的互作主要发生在细胞核。进一步加入 MDM2 抑制剂 Nutlin-3 后，BiFC 荧光信号呈时间和剂量依赖性减弱，流式细胞仪定量显示 10μM Nutlin-3 处理 6h 后荧光强度下降约 65%，直观证明了 Nutlin-3 可有效阻断 p53-MDM2 相互作用。
利用 BiFC 技术研究了 G 蛋白偶联受体 β2 肾上腺素能受体（β2AR）与 β-arrestin2 的相互作用及亚细胞定位动态。将 CFP 片段分别与 β2AR 和 β-arrestin2 融合，共转染 HEK293 细胞。基础状态下观察到微弱的细胞膜荧光；加入受体激动剂异丙肾上腺素后，细胞膜荧光迅速增强并在 5-10 min 达到峰值，随后荧光信号从细胞膜内吞至细胞质囊泡中，反映了受体-arrestin 复合物的内吞过程。激光共聚焦共定位分析显示，激动剂处理后 BiFC 荧光与早期内体标记 EEA1 的共定位系数从 0.12 升高至 0.68，证明了 β-arrestin2 介导的受体内吞机制。
Q&A 常见问题
BiFC 与 Co-IP、FRET 有什么区别？该如何选择？
Co-IP 是体外实验，裂解细胞后通过抗体沉淀蛋白复合物，适合验证蛋白互作的存在，但无法提供亚细胞定位和动态信息。BiFC 是活细胞内实验，通过荧光蛋白片段重组发光，可直观观察互作的亚细胞定位和动态变化，操作相对简单，但荧光片段重组是不可逆的，不适合观察快速解离过程。FRET（荧光共振能量转移）也是活细胞内技术，利用供体-受体荧光对的能量转移检测互作，可逆且时间分辨率高，但需要更精密的仪器和更复杂的数据分析。一般建议：初步验证用 Co-IP，活细胞定位和动态用 BiFC，快速动态过程用 FRET，多种方法结合结果更可靠。
BiFC 实验为什么会出现假阳性？如何避免？
BiFC 假阳性主要来自荧光蛋白片段的自组装（self-assembly）——即使两个融合蛋白不存在特异性相互作用，YN 和 YC 片段在高浓度表达时也可能随机碰撞并自发组装成荧光蛋白，产生背景荧光。避免方法：①设置严格的阴性对照，如蛋白突变体（破坏互作位点）、无关蛋白融合、单独表达 YN/YC 片段；②控制融合蛋白的表达量，避免过表达（使用弱启动子或降低质粒用量）；③选择合适的荧光蛋白片段拆分位点，某些拆分位点自组装背景较低；④优化培养温度，较低温度（如 30°C）可促进荧光蛋白正确折叠但也可能增加自组装，需根据实验调整。
BiFC 融合方向（N端/C端）如何选择？
融合方向的选择对 BiFC 实验结果至关重要。荧光蛋白片段需要融合在待测蛋白的不影响其折叠、定位和互作的一端。选择原则：①了解蛋白的结构域分布，避免将荧光片段融合在蛋白的功能结构域或互作结构域一侧；②了解蛋白的亚细胞定位信号，如 N 端信号肽、C 端内质网滞留信号（KDEL）等，荧光片段不能融合在含有定位信号的一端；③膜蛋白需考虑拓扑结构，胞内段和胞外段的选择；④如果不确定，建议同时构建 N 端融合和 C 端融合两种载体，筛选出有荧光信号且不影响蛋白定位的组合。南京高斯生物可根据蛋白结构信息提供融合方向建议。
BiFC 实验荧光信号弱或无荧光可能是什么原因？
BiFC 荧光信号弱或无荧光可能原因包括：①两个蛋白确实不存在相互作用；②融合方向不当，荧光片段被遮挡或影响了蛋白折叠和互作；③转染效率低，融合蛋白表达量不足；④荧光蛋白片段重组效率低，需要更长的培养时间或较低温度促进折叠；⑤蛋白定位不匹配，两个蛋白位于不同的亚细胞区域无法相遇；⑥荧光显微镜参数设置不当（曝光时间、增益、激发发射波长选择）。建议：优化融合方向、提高转染效率、延长培养时间（24-48h）、设置阳性对照（已知互作的蛋白对）、优化显微镜参数。
BiFC 可以用于药物筛选吗？如何定量？
可以。BiFC 非常适合用于筛选调控蛋白互作的药物或化合物。通过检测药物处理前后 BiFC 荧光强度的变化，可以定量评估药物对蛋白互作的增强或抑制作用。定量方法主要有两种：①流式细胞仪定量：收集细胞后用流式细胞仪检测荧光阳性细胞比例和平均荧光强度，适合大批量样本和高通量筛选；②荧光显微镜图像分析：用 ImageJ 等软件对荧光图片进行平均荧光强度定量，适合需要同时观察定位的实验。可绘制药物浓度-荧光强度曲线，计算 IC50 或 EC50 值。建议设置 DMSO 对照组、已知抑制剂阳性对照组，并进行生物学重复以保证统计效力。
